שיטה זו מאפשרת לגדל שלושה מינים שונים של חיידקים מגנטיים הנקראים MSR-1, AMB-1 ו- MS-1. כל מיני המים המתוקים, והכל מהמין מגנטוספיריום. זהו צעד ראשון חיוני עבור כל סוג של מחקר לשחזור מעורבים אורגניזמים אלה.
לחיידקים מגנטודקטיים יש דרישות חמצן ספציפיות מאוד, ולכן הם פיתחו מערכת ניווט מגנטית. לכן חשוב מאוד לשלוט בכמות החמצן העומדת לרשותם. כל הפרוטוקול הזה עבר אופטימיזציה לכמה זנים ספציפיים של מגנטוספירילה של מים מתוקים.
הפרטים שלה ניתן אופטימיזציה על מנת להתאים את דרישות החמצן וחומרים מזינים של חיידקים מגנטומטקטיים אחרים. התקינו בבטחה מיכל גז חנקן קרוב לספסל שעליו יש מספיק מקום להקים את תחנת החנקן. חבר פיסת צינורות למיכל כי הוא ארוך מספיק כדי להגיע לאזור שבו התחנה תיבנה.
במידת הצורך, להחיל קלטת טפלון על הפלט של המיכל, כדי למנוע דליפה. כדי לבנות תחנה המסוגלת לבעבע חמישה בקבוקי מדיום בו זמנית, חתכו ארבע חתיכות של צינורות באורך של חמישה סנטימטרים. להרכיב את חתיכות צינורות בשורה עם שלושה אביזרי פלסטיק בצורת T 3-way.
חבר קצה אחד של קו זה לחתיכת הצינורות בתפוקה של מיכל החנקן באמצעות אביזר נוסף בצורת T. מוסיפים תוסף מרפק ב-90 מעלות בקצה השני. השתמש בקלטת כדי לחבר את המבנה למוט מתכת אופקי ממוקם aproximately 30 ס"מ מעל הספסל.
חבר חמש חתיכות של צינורות של aproximately 20 ס"מ אורך לשלוש יציאות של אביזרי מותקן. הסר את הבוכנה מחמישה מזרקי פלסטיק מיליליטר אחד, וחתוך את הקצה הגדול יותר של מזרקים אלה, שמירה רק את החלק סיים. מלאו את המזרקים האלה כותנה, דואגים לא לארוז חזק מדי.
הכנס את המזרקים לחתיכות אנכיות באורך 20 ס"מ של צינורות. להפעיל את הגז, ולהשתמש במי סבון כדי להבטיח כי אין דליפה כאשר חנקן זורם. הסר את הכובעים של חמש מחטים מד 25 ולהכניס מחטים אלה לחתיכות 10 ס"מ של צינורות דקים.
חבר את המחטים המוכנות למזרקים של תחנת החנקן. ודא כי חנקן זורם דרך כל חמשת הקווים, ולשמור על התחנה בכוננות. הכן תווי ציטראט ברזליים 10 מילימולרים על ידי הוספת 0.245 גרם של ציטראט ברזלי ל -100 מיליליטר של מים מזוקקים deionized.
מחממים ומערבבים להתמוסס עד שמתקבל פתרון כתום וצויר. יש לבודד את הפתרון באופן אוטומטי באמצעות מחזור סטנדרטי של חשיפה של לפחות 15 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס לפני אחסון תווי המניות הסטריליים בטמפרטורת החדר בחושך. כדי להכין חמישה בקבוקים של מדיום צמיחה נוזלי עבור MSR-1, להוסיף את הכימיקלים המפורטים בפרוטוקול טקסט לתוך מקור המכיל 300 מיליליטר של מים מזוקקים deionized.
תוספת של ציטראט ברזל סטרילי ופתרונות מינרלים חייב להתבצע תחת הלהבה של מבער בונזן באמצעות טכניקות סטריליות. תנאים סטריליים חיוניים על מנת למנוע זיהום של התרבות על ידי מינים חיידקיים אחרים. לאחר תוספת של כל הכימיקלים, להתאים את ה- pH ל 7.0 עם פתרון אחד נתרן הידרוקסיד טוחן.
מחלקים את המדיום הטרי המוכן לבקבוקי סרום 125 מיליליטר, שופכים 60 מיליליטר של מדיום בכל בקבוק. חנקן בועה לתוך המדיום במשך 30 דקות כדי להסיר את החמצן מומס באמצעות צינורות קטנים מחובר לתחנת החנקן. מניחים פקק גומי בוטיל על גבי כל בקבוק, משאיר פתח קטן כדי לאפשר את הגז העודף לצאת מהבקבוק.
לאחר 30 דקות, crimp לאטום כל בקבוק עם פקק מוכן חותם אלומיניום. חותם האלומיניום מבטיח שהבקבוק יישאר אטום בשאר הפרוטוקול. נתק את המחטים ואת הצינור הדק מתחנת החנקן והחלף אותם במחטים נקיות.
כוונן את השסתומים של מיכל החנקן כך שזרימה עדינה ומתמשך של גז תצא מהמיכל. עכשיו, להכניס את אחד המחטים מחובר למיכל החנקן לבקבוק של מדיום דרך פקק הגומי. מיד להכניס מחט נקייה אחרת לתוך אותו בקבוק.
חזור על שלב זה עבור בקבוקים אחרים, ולתת חנקן לזרום במשך כ 30 דקות כדי להחליף את האוויר בבקבוקים על ידי חנקן. לאחר 30 דקות, לנתק בקבוק אחד מתחנת החנקן על ידי הסרת המחט המתאימה. המתן כמה שניות עד שהלחץ בבקבוק המדיום יקטן ללחץ אטמוספרי, והסר את המחט השנייה.
חזור על שלב זה עבור כל הבקבוקים הנותרים. כדי להכין 120 מיליליטר של מדיום צמיחה חצי סולידי עבור MSR-1, לכסות את המקור עם רדיד אלומיניום autoclave הפתרון מוכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. רגע לפני סיום מחזור ההידרוקסיד של הנתקלבה, הכינו פתרון טרי של 4%ציסטאין והתאיימו את ה-pH ל-7.0 עם פתרון חמישה נתרן הידרוקסידי טוחן, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר autoclaving, לתת את המדיום להתקרר עד 50 עד 60 מעלות צלזיוס, ולהביא את הקוסם תחת הלהבה של מבער בונזן. הסר את רדיד האלומיניום והוסף במהירות את הכימיקלים המפורטים בפרוטוקול הטקסט תוך שימוש בטכניקות סטריליות תוך ערבוב עדין. הוסף 1.2 מיליליטר של פתרון ציסטאין מעוקר מסנן.
לאחר תוספת של כל הכימיקלים, להעביר את המדיום החם לתוך 16 מיליליטר כובע בורג סטרילי צינורות Hungate. מעבירים 12 מיליליטר של המדיום לכל צינור, ואוטמים את הצינורות. כדי לחסן זנים MSR-1, AMB-1, ו MS-1 במדיום נוזלי, להבה את החלק העליון של החמצן ובקבוקים בינוניים טריים על ידי החלת אתנול על פקקים והעברתם דרך הלהבה של מבער בונזן.
באמצעות מזרק סטרילי ומחט, לחלץ מיליליטר אחד של חמצן מבקבוק החמצן ולהעביר אותו לתוך בקבוק בינוני טרי. אם משתמשים ב- inoculum מתרבות אחרת הגדלה בבקבוק זכוכית, להבה שני הבקבוקים. ואז לחסן מיליליטר אחד של התרבות הישנה לתוך המדיום הטרי.
הדגירה את התרבות ב 32 מעלות צלזיוס, ולחסן אותו למדיום טרי לאחר ארבעה עד שבעה ימים. כדי לחסן את MSR-1 במדיום חמצן, חצי סולידי, ודא כי הצינור של מדיום טרי מציג OAI מוגדר היטב, התממש על ידי ממשק ורוד עד חסר צבע על אחד עד שלושה סנטימטרים מתחת לפני השטח של המדיום. אם inoculum מגיע מתרבות אחרת שיפוע ריכוז חמצן חצי סולידי, לקצור את החיידקים על ידי שאפת 50 microliters של התרבות עם קצה פיפטה סטרילי להציב על הלהקה שנוצרה על ידי החיידקים.
לאט לאט לחסן חיידקים אלה ב OAI במדיום טרי, הימנעות להפריע את הממשק. לאטום את הצינור ולתת את החיידקים לגדול בין 25 מעלות צלזיוס ו 30 מעלות צלזיוס. כדי להבטיח כי החיידקים הם מגנטיים ומודאליים, מניחים טיפה של תרבות על להחליק כיסוי מיקרוסקופ.
הפוך את פתק הכיסוי והתקן אותו על טבעת O הנחה על שקופית זכוכית. ודא שהשחרור אינו נוגע בשקופית התחתונה. מניחים את טיפת התלייה מתחת למיקרוסקופ ומתמקדים בקצה של טיפה.
מניחים את הקוטב הדרומי של מגנט קרוב לקצה זה, ולראות את החיידקים לשחות לכיוון הקצה. הפוך את המגנט כדי לגרום להם לשחות בכיוון ההפוך. המוצגים כאן הם בקבוקי מדיה נוזלית לפני חיסון ואחרי צמיחה חיידקית.
מערבולת בבקבוק השני מצביעה על כך שחיידקים גדלים. סרט מואץ זה מציג פעמיים את התוצאה הצפויה של ניסוי טיפה תלוי לתרבות חיידקים מגנטיים מודאליים ומגנטיים. החיידקים שחו בתחילה לכיוון קצה טיפת כאשר שדה מגנטי מוחל.
כאשר כיוון השדה של המגנט מתהפך, החיידקים שחו הרחק מהקצה שבו מוחל השדה המגנטי. מוצגים כאן צינורות של מדיום חציסולי לפני חיסון ואחרי צמיחה חיידקית. כצפוי, רצועת חיידקים נוצרת בממשק האוקסי-אנוקסי ונודדת לאורך זמן כאשר החמצן נצרך והממשק עולה.
מוצג כאן הוא מיקרוגרף אלקטרונים מייצג של ספיריום מגנטי. הדגלה מסומנת על ידי החצים השחורים, בעוד החצים האדומים מראים את המגנטוסומים. כאשר מנסים הליך זה, חשוב מאוד לזכור כי חיידקים מגנטודקטיים יש דרישות רמת חמצן ספציפיות מאוד על מנת גם לגדול כראוי לייצר מגנטום.
פרוטוקול זה מראה כיצד לשלוט ולנטר את רמות החמצן בתקשורת הצמיחה על מנת להשיג את תנאי המיקרו המועדפים על ידי אורגניזמים אלה. בעקבות שיטה זו, ניתן להשיג ריכוזים גבוהים של תאים בריאים ומגנטיים מאוד. בדרך זו, ניסויים הדורשים כמויות גדולות של חיידקים יכולים להתבצע, כגון מיצוי מגנטום, מחקרים גנומיים וגנטיים, או תצפית על תנועה קולקטיבית על ידי מיקרוסקופיה.
האפשרות לגדל חיידקים מגנטיים במעבדה היא באמת מה שאיפשר למדענים לחקור באופן שיטתי את המאפיינים הביוכימיים והפיזיים המרתקים של אורגניזמים אלה.
