この方法は、MSR-1、AMB-1、およびMS-1と呼ばれる磁気性細菌の3つの異なる種を成長させることができます。すべての淡水種、およびすべて磁気刺激性の属から。これは、これらの生物を含む再現性のある研究の任意の種類のための不可欠な第一歩です。
磁気細菌は非常に特異的な酸素要件を有するため、磁気ナビゲーションシステムを開発しました。従って彼らが利用できる酸素の量を制御することは非常に重要である。このプロトコルのすべては淡水マグネトスピリラのいくつかの特定の株のために最適化されています。
その詳細は、他の磁気性細菌の酸素と栄養要件に対応するために最適化することができます。窒素ステーションを設置するのに十分なスペースがあるベンチの近くに窒素ガスタンクを安全に設置してください。駅が建設されるエリアに到達するのに十分な長さのタンクにチューブの一部を接続します。
必要に応じて、タンクの出力にテフロンテープを貼り、漏れを防ぎます。同時に5本の媒体をバブリングできるステーションを建設するには、無数に5センチメートルの長さのチューブ4個をカットします。3つの3ウェイT字型プラスチック継手でラインにチューブのピースを組み立てます。
このラインの一端を、余分なT字型のフィッティングを通して窒素タンクの出力でチューブの一端に接続します。反対側に 90 度のエルボフィッティングを追加します。テープを使用して、ベンチの上に30センチメートル上に近接して配置された水平金属棒に構造を取り付けます。
取付けられている継ぎ手の3つの出力に、長さが20センチメートルの無数のチューブの5枚を接続します。5つの1ミリリットルのプラスチック注射器からピストンを取り出し、これらのスポイトの大きな端を切り取り、卒業した部分だけを維持します。これらの注射器に綿を入れ、固く詰めすぎないように注意してください。
長さ20センチメートルの縦のチューブに注射器を挿入します。ガスを入れ、石鹸水を使って窒素が流れ出るときに漏れがないようにします。5本の25本のゲージ針のキャップを取り外し、これらの針を10センチメートルの細いチューブに挿入します。
準備した針を窒素ステーションの注射器に取り付けます。窒素が5本のラインすべてを通過していることを確認し、ステーションをスタンバイ状態に保ちます。10ミリモルのクエン酸フェリ酸フェクエン酸水を100ミリリットルの蒸留水に加えて、10ミリモルのクエン酸溶液を調製します。
熱し、オレンジ色の透明溶液が得られるまで溶解して攪拌する。滅菌されたストック溶液を暗闇の中で室温で貯蔵する前に、摂氏121度で少なくとも15分の露出の標準サイクルを使用して溶液をオートクレーブする。MSR-1用の液体成長培地の5本のボトルを調製するには、300ミリリットルの蒸留脱イオン水を含むビーカーにテキストプロトコルに記載されている化学物質を追加します。
滅菌技術を使用して、無菌のクエン酸およびミネラル溶液の添加は、ブンゼンバーナーの炎の下で行われなければなりません。滅菌状態は、他の細菌種による培養の汚染を避けるために不可欠である。すべての化学物質を添加した後、1つのモル水酸化ナトリウム溶液でpHを7.0に調整します。
作りたての培地を125ミリリットルの血清ボトルに分配し、各ボトルに60ミリリットルの培地を注ぎます。窒素を30分間培地中に泡立て、窒素ステーションに接続された小管を用いて溶存酸素を除去する。各ボトルの上にブチルゴムストッパーを置き、余分なガスがボトルを出るように小さな開口部を残します。
30分後、準備されたストッパーとアルミシールで各ボトルを圧着シールします。アルミニウムシールは、ボトルがプロトコルの残りの部分の間に密封されたままであることを保証します。窒素ステーションから針と薄いチューブを取り外し、清潔な針に交換します。
ガスの穏やかで連続的な流れがタンクを出るように窒素タンクの弁を調節しなさい。次に、窒素タンクに接続された針の1つをゴム栓を通して媒体のボトルに挿入します。すぐに別のきれいな針を同じボトルに入れます。
他のボトルについてもこのステップを繰り返し、約30分間窒素を流してボトル内の空気を窒素で置き換えます。30分後、対応する針を取り外して窒素ステーションからボトル1本を取り外します。培地のボトル内の圧力が大気圧に低下するまで数秒待ち、2番目の針を取り除きます。
残りのすべてのボトルに対してこの手順を繰り返します。MSR-1用の半固体成長培地を120ミリリットル調製するには、ビーカーをアルミニウム箔で覆い、テキストプロトコルに記載されているように調製した溶液をオートクレーブします。オートクレーブサイクルの終了直前に、新しい4%システイン溶液を調製し、テキストプロトコルに記載されているように、5モル水酸化ナトリウム溶液でpHを7.0に調整します。
オートクレーブした後、培地を摂氏50~60度まで冷やし、ブンゼンバーナーの炎の下にビーカーを持って来ます。アルミホイルを取り外し、静かにかき混ぜながら滅菌技術を使用してテキストプロトコルに記載されている化学物質を素早く追加します。1.2ミリリットルのフィルター滅菌システイン溶液を加えます。
すべての化学物質を添加した後、16ミリリットルの無菌スクリューキャップハンゲートチューブに暖かい媒体を移します。各チューブに媒体の12ミリリットルを移し、チューブを密封します。液体媒体中のMSR-1、AMB-1、MS-1の菌株を接種するには、ストッパーにエタノールを塗布し、ブンゼンバーナーの炎を通して、酸素と新鮮なミディアムボトルの上部を炎上させます。
滅菌注射器と針を使用して、酸素ボトルから1ミリリットルの酸素を抽出し、新鮮な媒体ボトルに移します。ガラス瓶で栽培された別の培養物の接種を使用する場合は、両方のボトルを炎上します。その後、古い文化の1ミリリットルを新鮮な培地に接種する。
32°Cで培養し、4〜7日後に新鮮な培地に接種します。MSR-1を酸素勾配、半固体培地に接種するために、新鮮な媒体のチューブが、培地表面の約1〜3センチメートル下のピンクから無色の界面で具体化された明確に定義されたOAIを表示することを確認する。接種物が別の酸素濃度勾配半固体培養から来ている場合、細菌によって形成されたバンドに配置された滅菌ピペットチップで培養物の50マイクロリットルを吸引することによって細菌を収穫する。
これらの細菌をOAIで新鮮な媒体でゆっくりと接種し、界面を乱さないようにします。チューブを密封し、細菌は摂氏25度と摂氏30度の間で成長させます。細菌が磁気とモーダルの両方であることを確認するには、顕微鏡カバースリップに培養液を一滴置きます。
カバースリップをめくり、ガラススライドの上に置いたOリングに取り付けます。ドロップが下部のスライドに触れていないことを確認します。吊り下げ液を顕微鏡の下に置き、液滴の縁に焦点を合わせます。
磁石の南極をその端に近づけ、細菌が縁に向かって泳ぐのを見ます。磁石を反転して、反対方向に泳ぎます。ここに示されているのは、接種前と細菌増殖後の液体培地のボトルです。
第2のボトルの濁りは、細菌が成長していることを示しています。この2回の加速映画は、モーダルおよび磁気磁気磁気磁気性細菌培養のための吊り下げ実験の期待される結果を示しています。細菌は、磁場が印加されると、最初は液滴の端に向かって泳いだ。
磁石の磁場方向が逆になると、細菌は磁場が加えられる縁から離れて泳いだ。ここに示されているのは、接種前および細菌増殖後の半固体培地のチューブである。予想通り、細菌のバンドはオキシアノキシック界面で形成され、酸素が消費され、界面が上に移動するにつれて時間の経過とともに移動します。
ここに示されている磁気スピリルラムの代表的な電子顕微鏡写真である。旗エラは黒い矢印で示され、赤い矢印はマグネソソームを示しています。この手順を試みるとき,磁気学的細菌は適切に成長し,磁気ソーマを生成するためには非常に特異的な酸素レベルの要件を有することを覚えておくことが非常に重要です。
このプロトコルは、これらの生物が好む微量条件を達成するために、成長培地中の酸素レベルを制御および監視する方法を示す。この方法に従って、高濃度の健康で高い磁気細胞が得られる。このようにして、大量の細菌を必要とする実験、例えば磁気抽出、ゲノムおよび遺伝学的研究、または顕微鏡による集団運動の観察が行われる。
実験室で磁気性細菌を成長させる可能性は、科学者がこれらの生物の魅力的な生化学的および物理的性質を体系的に探求することを可能にしたものです。
