Diese Methode ermöglicht den Anbau von drei verschiedenen Arten von magnetotaktischen Bakterien namens MSR-1, AMB-1 und MS-1. Alle Süßwasserarten, und alle aus der Gattung magnetospirillum. Es ist ein wesentlicher erster Schritt für jede Art von reproduzierbarer Forschung mit diesen Organismen.
Magnetotaktische Bakterien haben einen sehr spezifischen Sauerstoffbedarf, weshalb sie ein magnetisches Navigationssystem entwickelt haben. Es ist daher sehr wichtig, die Menge an Sauerstoff zu kontrollieren, die ihnen zur Verfügung steht. All dieses Protokoll wurde für einige spezifische Stämme von Süßwassermagnetospirilla optimiert.
Seine Details können optimiert werden, um den Sauerstoff- und Nährstoffbedarf anderer magnetotaktischer Bakterien zu decken. Installieren Sie sicher einen Stickstoff-Gastank in der Nähe einer Bank, auf der genügend Platz zum Aufstellen der Stickstoffstation vorhanden ist. Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Tank an, der lang genug ist, um den Bereich zu erreichen, in dem die Station gebaut wird.
Falls erforderlich, tragen Sie Teflonband am Ausgang des Tanks auf, um Leckagen zu vermeiden. Um eine Station zu bauen, die in der Lage ist, fünf Flaschen Medium gleichzeitig zu sprudeln, schneiden Sie vier Stück Schläuche von ungefähr fünf Zentimeter n Länge. Montieren Sie die Rohre in einer Linie mit drei 3-Wege-T-förmigen Kunststoffarmaturen.
Verbinden Sie ein Ende dieser Leitung mit dem Schlauchstück am Ausgang des Stickstofftanks durch eine zusätzliche T-förmige Armatur. Fügen Sie am anderen Ende einen 90-Grad-Ellenbogenanbau hinzu. Verwenden Sie Klebeband, um die Struktur an einer horizontalen Metallstange zu befestigen, die ungefähr 30 Zentimeter über der Bank platziert ist.
Verbinden Sie fünf Schlauchstücke von ca. 20 Zentimetern Länge mit den drei Ausgängen der installierten Armaturen. Entfernen Sie die Kolben von fünf Ein-Milliliter-Kunststoffspritzen, und schneiden Sie das größere Ende dieser Spritzen, wobei nur das abgestufte Teil beibehalten wird. Füllen Sie diese Spritzen mit Baumwolle, wobei Sie darauf achten, nicht zu fest zu verpacken.
Legen Sie die Spritzen in die 20 Zentimeter langen vertikalen Schläuche ein. Schalten Sie das Gas ein, und verwenden Sie Seifenwasser, um sicherzustellen, dass es kein Leck gibt, wenn Stickstoff fließt. Entfernen Sie die Kappen von fünf 25-Meter-Nadeln und legen Sie diese Nadeln in 10-Zentimeter-Stücke von dünnen Schläuchen.
Befestigen Sie die vorbereiteten Nadeln an den Spritzen der Stickstoffstation. Stellen Sie sicher, dass Stickstoff durch alle fünf Leitungen fließt, und halten Sie die Station in Bereitschaft. Bereiten Sie eine 10-Millimolar-Ferriccitrat-Lösung vor, indem Sie 0,245 Gramm Eisencitrat zu 100 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser hinzufügen.
Erhitzen und rühren, bis eine orange klare Lösung erhalten ist. Autoklaven Sie die Lösung mit einem Standardzyklus von mindestens 15 Minuten Belichtungbeiszeit bei 121 Grad Celsius, bevor Sie die sterilisierte Lagerlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern. Um fünf Flaschen flüssiges Wachstumsmedium für MSR-1 vorzubereiten, fügen Sie die in einem Textprotokoll aufgeführten Chemikalien zu einem Becher hinzu, der 300 Milliliter destilliertes deionisiertes Wasser enthält.
Die Zugabe der sterilen Eisencitrat- und Minerallösungen muss unter der Flamme eines Bunsenbrenners mit sterilen Techniken erfolgen. Sterile Bedingungen sind unerlässlich, um eine Kontamination der Kultur durch andere Bakterienarten zu vermeiden. Nach Zugabe aller Chemikalien den pH-Wert mit einer mollaren Natriumhydroxidlösung auf 7,0 einstellen.
Das frisch zubereitete Medium in 125-Milliliter-Serumflaschen geben und 60 Milliliter Medium in jede Flasche gießen. Blasen Sie Stickstoff 30 Minuten lang in das Medium, um den gelösten Sauerstoff mit den kleinen Schläuchen zu entfernen, die mit der Stickstoffstation verbunden sind. Legen Sie einen Butylkautschukstopfen auf jede Flasche und lassen Sie eine kleine Öffnung, damit das überschüssige Gas die Flasche verlassen kann.
Nach 30 Minuten versiegeln Sie jede Flasche mit dem vorbereiteten Stopfen und einer Aluminiumdichtung. Die Aluminiumdichtung sorgt dafür, dass die Flasche während des restlichen Protokolls versiegelt bleibt. Trennen Sie die Nadeln und die dünnen Schläuche von der Stickstoffstation und ersetzen Sie sie durch saubere Nadeln.
Stellen Sie die Ventile des Stickstofftanks so ein, dass ein sanfter, kontinuierlicher Gasfluss aus dem Tank austritt. Legen Sie nun eine der mit dem Stickstofftank verbundenen Nadeln durch den Gummistopfen in eine Flasche Medium ein. Legen Sie sofort eine weitere saubere Nadel in dieselbe Flasche ein.
Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Flaschen, und lassen Sie Stickstoff für etwa 30 Minuten fließen, um die Luft in den Flaschen durch Stickstoff zu ersetzen. Trennen Sie nach 30 Minuten eine Flasche von der Stickstoffstation, indem Sie die entsprechende Nadel entfernen. Warten Sie einige Sekunden, bis der Druck in der Flasche Medium auf atmosphärischen Druck abnimmt, und entfernen Sie die zweite Nadel.
Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Flaschen. Um 120 Milliliter halbfestes Wachstumsmedium für MSR-1 vorzubereiten, bedecken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und autoklavieren Sie die im Textprotokoll beschriebene Lösung. Kurz vor dem Ende des Autoklavenzyklus eine frische 4%Cystein-Lösung vorbereiten und den pH-Wert mit einer fünfmollaren Natriumhydroxidlösung auf 7,0 einstellen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach dem Autoklavieren das Medium auf 50 bis 60 Grad Celsius abkühlen lassen und den Becher unter die Flamme eines Bunsenbrenners bringen. Entfernen Sie die Aluminiumfolie und fügen Sie schnell die im Textprotokoll aufgeführten Chemikalien mit sterilen Techniken unter sanftem Rühren hinzu. Fügen Sie 1,2 Milliliter Filter sterilisierte Cystein-Lösung.
Nach Zugabe aller Chemikalien, übertragen Sie das warme Medium in 16 Milliliter sterile Schraubverschluss Hungate Rohre. 12 Milliliter des Mediums in jedes Rohr geben und die Rohre versiegeln. Um die Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1 in flüssigem Medium zu impfen, flamen Sie die Oberteile der Sauerstoff- und frischmedium Flaschen, indem Sie Ethanol auf die Stopfen auftragen und sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners durchqueren.
Mit einer sterilen Spritze und einer Nadel einen Milliliter Sauerstoff aus der Sauerstoffflasche extrahieren und in die frische Mittelflasche geben. Wenn Sie das Inokulum aus einer anderen Kultur verwenden, das in einer Glasflasche angebaut wird, flamen Sie beide Flaschen. Dann impfen Sie einen Milliliter der älteren Kultur in das frische Medium.
Die Kultur bei 32 Grad Celsius bebrüten und nach vier bis sieben Tagen in ein frisches Medium einfließen lassen. Um MSR-1 im Sauerstoffgradienten zu impfen, halbfestes Medium, überprüfen Sie, ob das Rohr des frischen Mediums eine klar definierte OAI anzeigt, die durch eine rosa bis farblose Schnittstelle etwa ein bis drei Zentimeter unter der Oberfläche des Mediums materialisiert wird. Wenn das Inokulum aus einer anderen Sauerstoffkonzentration Gradient semisolid Kultur kommt, ernten Sie die Bakterien durch Ansaugung 50 Mikroliter der Kultur mit einer sterilen Pipettenspitze auf dem Band von den Bakterien gebildet platziert.
Impfen Sie diese Bakterien am OAI langsam im frischen Medium, um eine Störung der Schnittstelle zu vermeiden. Versiegeln Sie die Röhre und lassen Sie die Bakterien zwischen 25 Grad Celsius und 30 Grad Celsius wachsen. Um sicherzustellen, dass die Bakterien sowohl magnetisch als auch modal sind, legen Sie einen Tropfen Kultur auf mikroskopische Abdeckung Schlupf.
Drehen Sie den Deckel-Slip, und installieren Sie ihn auf einem O-Ring, der auf einer Glasrutsche ruht. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen die untere Folie nicht berührt. Legen Sie den hängenden Tropfen unter das Mikroskop und konzentrieren Sie sich auf eine Kante des Tröpfchens.
Platzieren Sie den Südpol eines Magneten in der Nähe dieser Kante, und beobachten Sie, wie die Bakterien in Richtung randschwimmen. Drehen Sie den Magneten, um sie in die entgegengesetzte Richtung schwimmen zu lassen. Hier sind die Flaschen mit flüssigen Medien vor der Impfung und nach dem Bakterienwachstum zu sehen.
Trübung in der zweiten Flasche zeigt an, dass Bakterien wachsen. Dieser zweifache beschleunigte Film zeigt das erwartete Ergebnis eines Hängendrop-Experiments für eine modale und magnetische magnetotaktische Bakterienkultur. Die Bakterien schwammen zunächst an den Rand des Tröpfchens, wenn ein Magnetfeld aufgebracht wird.
Wenn die Feldrichtung des Magneten umgekehrt ist, schwammen die Bakterien von der Kante weg, wo das Magnetfeld aufgebracht wird. Gezeigt werden hier Röhren von semifestem Medium vor der Impfung und nach bakteriellem Wachstum. Wie erwartet bildet sich an der oxisch-anoxischen Schnittstelle ein Bakterienband, das im Laufe der Zeit wandert, wenn Sauerstoff verbraucht wird und die Schnittstelle nach oben bewegt.
Hier ist eine repräsentative Elektronenmikroskopie eines magnetischen Spirillums zu sehen. Die Flagella werden durch die schwarzen Pfeile angezeigt, während die roten Pfeile die Magnetosomen zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass magnetotaktische Bakterien sehr spezifische Sauerstoffgehaltsanforderungen haben, um sowohl richtig zu wachsen als auch Magnetoszuzin zu produzieren.
Dieses Protokoll zeigt, wie der Sauerstoffgehalt in den Wachstumsmedien kontrolliert und überwacht wird, um die von diesen Organismen bevorzugten Mikrobedingungen zu erreichen. Nach dieser Methode können hohe Konzentrationen gesunder und hochmagnetischer Zellen erreicht werden. Auf diese Weise können Experimente durchgeführt werden, die große Mengen an Bakterien erfordern, wie magnetosome Extraktion, genomische und genetische Studien, oder Beobachtung der kollektiven Bewegung durch Mikroskopie.
Die Möglichkeit, magnetotaktische Bakterien im Labor anzubauen, ist wirklich das, was es Wissenschaftlern ermöglicht hat, systematisch die faszinierenden biochemischen und physikalischen Eigenschaften dieser Organismen zu erforschen.
