Este método permite el cultivo de tres especies diferentes de bacterias magnetotácticas llamadas MSR-1, AMB-1 y MS-1. Todas las especies de agua dulce, y todas del género magnetospirillum. Es un primer paso esencial para cualquier tipo de investigación reproducible que involucre a estos organismos.
Las bacterias magnetotácticas tienen requisitos de oxígeno muy específicos, por lo que desarrollaron un sistema de navegación magnética. Por lo tanto, es muy importante controlar la cantidad de oxígeno disponible para ellos. Todo este protocolo ha sido optimizado para algunas cepas específicas de magnetospirilla de agua dulce.
Sus detalles se pueden optimizar para adaptarse a los requisitos de oxígeno y nutrientes de otras bacterias magnetotácticas. Instale de forma segura un tanque de gas nitrógeno cerca de un banco en el que haya suficiente espacio para instalar la estación de nitrógeno. Conecte un trozo de tubo al tanque que sea lo suficientemente largo como para llegar a la zona donde se construirá la estación.
Si es necesario, aplique cinta de teflón a la salida del tanque para evitar cualquier fuga. Para construir una estación capaz de burbujear cinco botellas de medio al mismo tiempo, cortar cuatro trozos de tubo de aproximadamente cinco centímetros de longitud. Montar las piezas de tubo en una línea con tres accesorios de plástico en forma de T de 3 vías.
Conecte un extremo de esta línea a la pieza de tubo a la salida del tanque de nitrógeno a través de un accesorio adicional en forma de T. Agregue un accesorio de codo de 90 grados en el otro extremo. Utilice cinta adhesiva para fijar la estructura a una varilla metálica horizontal colocada aproximadamente 30 centímetros por encima del banco.
Conecte cinco piezas de tubo de aproximadamente 20 centímetros de longitud a las tres salidas de los accesorios instalados. Retire los pistones de cinco jeringas de plástico de un mililitro y corte el extremo más grande de estas jeringas, manteniendo sólo la parte graduada. Llene estas jeringas con algodón, teniendo cuidado de no empacar demasiado apretado.
Inserte las jeringas en las piezas verticales de tubo de 20 centímetros de largo. Encienda el gas y use agua jabonosa para asegurarse de que no haya fugas cuando el nitrógeno fluya. Retire las tapas de cinco agujas de calibre 25 e inserte estas agujas en trozos de tubo delgado de 10 centímetros.
Fije las agujas preparadas a las jeringas de la estación de nitrógeno. Asegúrese de que el nitrógeno fluye a través de las cinco líneas y mantenga la estación en espera. Preparar una solución de citrato férrico de 10 milímetros añadiendo 0,245 gramos de citrato férrico a 100 mililitros de agua desionizada destilada.
Caliente y revuelva para disolver hasta obtener una solución transparente de naranja. Autoclave la solución utilizando un ciclo estándar de al menos 15 minutos de exposición a 121 grados Celsius antes de almacenar la solución de stock esterilizado a temperatura ambiente en la oscuridad. Para preparar cinco botellas de medio de crecimiento líquido para MSR-1, agregue los productos químicos enumerados en un protocolo de texto a un vaso de precipitados que contenga 300 mililitros de agua desionizada destilada.
La adición del citrato férrico estéril y las soluciones minerales deben realizarse bajo la llama de un quemador Bunsen utilizando técnicas de esterilización. Las condiciones estériles son esenciales para evitar la contaminación del cultivo por otras especies bacterianas. Después de la adición de todos los productos químicos, ajuste el pH a 7.0 con una solución de hidróxido de sodio molar.
Dispensar el medio recién preparado en botellas de suero de 125 mililitros, vertiendo 60 mililitros de medio en cada botella. Burbuja de nitrógeno en el medio durante 30 minutos para eliminar el oxígeno disuelto utilizando el pequeño tubo conectado a la estación de nitrógeno. Coloque un tapón de goma de butilo en la parte superior de cada botella, dejando una pequeña abertura para permitir que el exceso de gas salga de la botella.
Después de 30 minutos, engarce cada botella con el tapón preparado y un sello de aluminio. El sello de aluminio asegura que la botella permanezca sellada durante el resto del protocolo. Desconecte las agujas y el tubo delgado de la estación de nitrógeno y reemplácelas con agujas limpias.
Ajuste las válvulas del tanque de nitrógeno para que un flujo suave y continuo de gas salga del tanque. Ahora, inserte una de las agujas conectadas al tanque de nitrógeno en una botella de medio a través del tapón de goma. Inserte inmediatamente otra aguja limpia en el mismo frasco.
Repita este paso para las otras botellas y deje que el nitrógeno fluya durante unos 30 minutos para reemplazar el aire de las botellas por nitrógeno. Después de 30 minutos, desconecte una botella de la estación de nitrógeno retirando la aguja correspondiente. Espere unos segundos hasta que la presión en la botella de medio disminuya a la presión atmosférica y retire la segunda aguja.
Repita este paso para todas las botellas restantes. Para preparar 120 mililitros de medio de crecimiento semisólido para MSR-1, cubra el vaso con papel de aluminio y autoclave la solución preparada como se describe en el protocolo de texto. Justo antes del final del ciclo de autoclave, preparar una solución fresca de 4% de cisteína y ajustar el pH a 7.0 con una solución de hidróxido de sodio de cinco molares, como se describe en el protocolo de texto.
Después del autoclaving, deje que el medio se enfríe a 50 a 60 grados Celsius, y lleve el vaso bajo la llama de un quemador Bunsen. Retire la lámina de aluminio y agregue rápidamente los productos químicos enumerados en el protocolo de texto utilizando técnicas estériles mientras agita suavemente. Añadir 1,2 mililitros de solución de cisteína esterilizada por filtro.
Después de la adición de todos los productos químicos, transferir el medio caliente en 16 mililitros tubos de tornillo estéril Hungate. Transfiera 12 mililitros del medio a cada tubo y selle los tubos. Para inocular cepas MSR-1, AMB-1 y MS-1 en medio líquido, enmasca las tapas de las botellas medianas de oxígeno y fresco aplicando etanol en los tapones y pasándolas a través de la llama de un quemador Bunsen.
Con una jeringa estéril y una aguja, extraiga un mililitro de oxígeno de la botella de oxígeno y transfiéralo al frasco mediano fresco. Si utiliza el inóculo de otro cultivo cultivado en una botella de vidrio, entella ambas botellas. Luego inocular un mililitro de la cultura más antigua en el medio fresco.
Incubar el cultivo a 32 grados centígrados, e inocularlo en medio fresco después de cuatro a siete días. Para inocular MSR-1 en gradiente de oxígeno, medio semisólido, verifique que el tubo de medio fresco muestre un OAI bien definido, materializado por una interfaz de color rosa a incoloro de uno a tres centímetros por debajo de la superficie del medio. Si el inóculo proviene de otro cultivo semisólido gradiente de concentración de oxígeno, cosecha las bacterias aspirando 50 microlitros del cultivo con una punta de pipeta estéril colocada en la banda formada por las bacterias.
Inocular lentamente estas bacterias en la OAI en el medio fresco, evitando perturbar la interfaz. Sella el tubo y deja que las bacterias crezcan entre 25 grados Centígrados y 30 grados centígrados. Para asegurarse de que las bacterias son magnéticas y modales, coloque una gota de cultivo en el resbalón de la cubierta del microscopio.
Voltee el resbalón de la cubierta e instálelo en una junta tórica que descansa sobre un portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que la caída no toque la diapositiva inferior. Coloque la gota colgante debajo de un microscopio y concéntrese en un borde de la gota.
Coloque el polo sur de un imán cerca de ese borde, y observe cómo las bacterias nadan hacia el borde. Voltear el imán para hacerlos nadar en la dirección opuesta. Aquí se muestran las botellas de medios líquidos antes de la inoculación y después del crecimiento bacteriano.
La turbidez en la segunda botella indica que las bacterias están creciendo. Esta película acelerada dos veces muestra el resultado esperado de un experimento de gota colgante para un cultivo de bacterias magnetotácticas modales y magnéticas. Las bacterias inicialmente nadaron hacia el borde de la gota cuando se aplica un campo magnético.
Cuando se invierte la dirección del campo del imán, las bacterias nadan lejos del borde donde se aplica el campo magnético. Aquí se muestran tubos de medio semisólido antes de la inoculación y después del crecimiento bacteriano. Como era de esperar, una banda de bacterias se forma en la interfaz oxic-anoxic y migra con el tiempo a medida que se consume oxígeno y la interfaz se mueve hacia arriba.
Aquí se muestra un micrografo electrónico representativo de un spirillum magnético. La flagelación se indica mediante las flechas negras, mientras que las flechas rojas muestran los magnetosomas. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que las bacterias magnetotácticas tienen requisitos de nivel de oxígeno muy específicos para crecer adecuadamente y producir magnetosoma.
Este protocolo muestra cómo controlar y monitorear los niveles de oxígeno en los medios de crecimiento con el fin de lograr las micro condiciones preferidas por estos organismos. Siguiendo este método, se pueden obtener altas concentraciones de células sanas y altamente magnéticas. De esta manera, se pueden realizar experimentos que requieren grandes cantidades de bacterias, como la extracción de magnetosomas, estudios genómicos y genéticos, o la observación del movimiento colectivo por microscopía.
La posibilidad de cultivar bacterias magnetotácticas en el laboratorio es realmente lo que ha permitido a los científicos explorar de manera sistemática las fascinantes propiedades bioquímicas y físicas de estos organismos.
