这种方法允许种植三种不同种类的磁体细菌,称为MSR-1、AMB-1和MS-1。所有淡水物种,全部来自磁磷属。对于涉及这些生物体的任何可重复研究来说,这是重要的第一步。
磁力细菌对氧气的要求非常特殊,这也是他们开发磁力导航系统的原因。因此,控制他们可用的氧气量是非常重要的。所有这些协议都针对一些特定的淡水磁螺旋菌株进行了优化。
其细节可以优化,以适应其他磁体细菌的氧气和营养需求。在长凳附近安全安装氮气罐,该长凳上有足够的空间来设置氮气站。将一根管子连接到储罐,该油管足够长,可以到达空间站的建造区域。
如有必要,在油箱输出时涂抹特氟隆胶带,以避免任何泄漏。要建造一个能够同时冒泡五瓶介质的站,切开四块长约五厘米的管子。将管子与三个 3 向 T 形塑料配件组装成一条线。
通过额外的 T 形接头将此生产线的一端连接到氮气罐输出端的油管。在另一端添加 90 度弯头接头。使用胶带将结构连接到水平金属棒上,该金属棒位于长凳上方约 30 厘米处。
将五条长度约 20 厘米的油管连接到已安装配件的三个输出。从五个一毫升塑料注射器中拆下活塞,并切割这些注射器的较大端,只保留分级部分。用棉花填充这些注射器,注意不要包装太紧。
将注射器插入 20 厘米长的垂直管片中。打开气体,并使用肥皂水确保氮气流动时没有泄漏。取下五根 25 针的帽,并将这些针头插入 10 厘米的薄管中。
将准备好的针头连接到氮气站的注射器上。确保氮气流经所有五条线路,并保持站内待命。通过将 0.245 克柠檬酸盐加入 100 毫升蒸馏去压水,准备 10 毫摩尔柠檬酸化液溶液。
加热和搅拌溶解,直到获得橙色透明溶液。在121摄氏度下使用至少15分钟的暴露标准周期进行灭菌,然后在黑暗中将灭菌库存溶液储存在室温下。要为 MSR-1 准备五瓶液体生长介质,请将文本协议中列出的化学物质添加到含有 300 毫升蒸馏去水杯的烧杯中。
在使用灭菌技术下,必须在Bunsen燃烧器的火焰下添加无菌柠檬酸盐和矿物溶液。无菌条件对于避免其他细菌物种对培养物的污染至关重要。添加所有化学品后,使用一种氢氧化钠溶液将pH调至7.0。
将新鲜准备好的介质放入 125 毫升血清瓶中,在每个瓶子中倒入 60 毫升的介质。将氮气泡入介质 30 分钟,使用连接到氮站的小管清除溶解氧。在每个瓶子的顶部放置一个丁基橡胶塞,留下一个小开口,让多余的气体离开瓶子。
30 分钟后,用准备好的塞子和铝密封密封每个瓶子。铝密封确保瓶子在协议的其余部分保持密封。断开针头和细管与氮气站的连接,用干净的针头更换。
调节氮气罐的阀门,使温和、连续的气体流出油箱。现在,通过橡胶塞将连接到氮气罐的一根针头插入一瓶介质中。立即将另一根干净的针头插入同一瓶。
对其他瓶子重复此步骤,让氮气流动约 30 分钟,用氮气代替瓶子中的空气。30 分钟后,通过取出相应的针头,将一瓶从氮气站断开。等待几秒钟,直到介质瓶中的压力减小到大气压力,然后取出第二根针。
对所有剩余瓶子重复此步骤。要为 MSR-1 准备 120 毫升的半固体生长介质,请用铝箔盖住烧杯,并像文本协议中所述那样对解决方案进行解处理。就在自动处理器循环结束之前,准备一个新的 4%半胱氨酸溶液,并使用五摩尔氢氧化钠溶液将 pH 调整为 7.0,如文本协议中所述。
高压灭式后,让介质冷却至50至60摄氏度,并将烧杯放在Bunsen燃烧器的火焰下。取出铝箔,在轻轻搅拌的同时,使用无菌技术快速添加文本协议中列出的化学物质。加入1.2毫升过滤器灭菌半胱氨酸溶液。
添加所有化学品后,将加热介质转移到 16 毫升无菌螺帽 Hungate 管中。将12毫升的介质转移到每个管中,并密封管。要接种液体介质中的MSR-1、AMB-1和MS-1菌株,在塞子上涂乙醇并通过Bunsen燃烧器的火焰传递,点燃氧气和新鲜介质瓶的顶部。
使用无菌注射器和针头,从氧气瓶中提取一毫升氧气,然后转移到新鲜的中瓶中。如果使用另一种培养在玻璃瓶中生长的培养剂,则点燃两个瓶子。然后将一毫升的较旧培养剂接种到新鲜培养中。
在32摄氏度下孵育该培养,并在四至七天后接种到新鲜培养中。要接种氧气梯度、半固体介质中的 MSR-1,请验证新鲜介质管是否显示定义明确的 OAI,该管由粉红色到无色界面实现,该接口距离介质表面大约一到三厘米。如果注射液来自另一种氧气浓度梯度半固体培养物,则通过吸入培养物的50微升来收获细菌,并放置一个无菌移液器尖端,放在细菌形成的带子上。
在OAI以新鲜介质中缓慢接种这些细菌,避免干扰界面。密封管子,让细菌生长在25摄氏度到30摄氏度之间。为了确保细菌既具有磁性,又具有模态性,请将一滴培养力放在显微镜盖上。
翻转盖滑,并将其安装在放在玻璃滑梯上的 O 环上。确保跌落不接触底部幻灯片。将悬挂的落液放在显微镜下,并聚焦在液滴的边缘。
将磁铁的南极靠近该边缘,观察细菌向边缘游去。翻转磁铁,让他们游向相反的方向。这里展示的是在接种前和细菌生长后,液体介质的瓶子。
第二瓶的浊度表明细菌正在生长。这两次加速电影显示了模态和磁磁体细菌培养的悬挂滴实验的预期结果。当施加磁场时,细菌最初游向液滴的边缘。
当磁体的磁场方向反转时,细菌游离施加磁场的边缘。这里显示的是在接种前和细菌生长后半固体介质管。不出所料,一带细菌在氧化-厌氧界面形成,随着氧气的消耗和界面向上移动而随时间而迁移。
这里展示的是磁尖子的代表性电子显微图。旗子由黑色箭头指示,而红色箭头表示磁体。在尝试此过程时,重要的是要记住,磁体细菌有非常具体的氧气水平要求,以便正确生长和产生磁体体。
该协议演示如何控制和监测生长介质中的氧含量,以实现这些生物体所首选的微观条件。按照这种方法,可以获得高浓度的健康和高磁性细胞。这样,可以进行需要大量细菌的实验,如磁体提取、基因组和基因研究,或通过显微镜观察集体运动。
在实验室中生长磁体细菌的可能性确实让科学家能够系统地探索这些生物体的迷人生化和物理特性。