poly균 패혈증을 위한 세칼 슬러리 모형은 독특한 신생아 병리 생리학을 해부하는 강력한 공구입니다. 변수가 될 수 있으며 인도적 끝점은 잘 설명되지 않습니다. 여기서 우리는 세칼 슬러리를 준비하고 실험 동물에 주입하기 위해 매우 표준화 된 절차를 제시합니다.
또한 데이터 기반 접근 방식을 사용하여 가능한 한 빨리 moribund 새끼를 식별합니다. 먼저 냉동 세칼 슬러리 스톡을 준비합시다. 이것은 적어도 5 명의 성인 마우스에서 세칼 콘센트를 풀링하고, 멸균 덱스트로스 물에 중단하고, 나중에 사용하기 위해 마이너스 80에서 저장하여 수행됩니다.
당신은 남성 또는 여성을 사용할 수 있습니다, 하지만 섹스, 나이, 당신의 실험에 대 한 마우스의 배경 일정 유지 해야. 먼저, 해부를 위해 도구를 준비합시다. 여기에는 피부를 위한 가위와 집게 세트와 내부 장기를 위한 두 번째 세트가 포함됩니다.
사용 30분 전에 뜨거운 비드 소독제를 켭니다. 공구를 70%에 담근 다음 뜨거운 비드 소독기에 1분 이상 담급드세요. 70%에탄올로 종이 타월 매트를 뿌린 다음 공구의 멸균 된 부분을 다른 도구의 멸균 되지 않는 손잡이에 건드리지 않고 소독기에서 도구를 제거합니다.
식히기 위해 종이 타월에 놓습니다. 생물학적 안전 캐비닛에 마우스를 해부합니다. 마우스의 다리를 23 게이지 바늘을 사용하여 스티로폼 보드에 고정하여 마우스가 복부를 위로 합니다.
70%에탄올로 복부를 스프레이합니다. 멸균 집게와 가위를 사용하여 피부를 잘라 가위로 간막 안감에서 피부를 느슨하게하고 사타구니에서 흉골과 왼쪽에서 오른쪽으로 직사각형 영역을 엽니 다. 복막 주위의 털을 제거합니다.
복막을 잘라 멸균 도구의 새로운 쌍으로 전환, 또한 직사각형 개방을 만들기. 신체를 가로 질러 오른쪽으로 왼쪽으로 실행해야하는 cecum을 식별합니다. 내관 에서 cecum 가지를 식별 하 고 창 자에서 멀리 cecum을 잘라 결합 조직을 중단.
살균된 계량 용지에 놓습니다. 멸균 도구를 사용하여, cecum의 양쪽 끝을 잘라. 집게로 cecum의 중간을 잡고 평평한 금속 주걱을 사용하여 롤링 모션을 사용하여 cecal 내용물을 끝에서 부드럽게 밀어 냅니다.
콘텐츠를 수집하고 미리 계량된 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 최대 5마리의 마우스에서 동일한 튜브로 세칼 함량을 풀. 모든 내용이 추가되면 튜브의 가중치를 다시 사용합니다.
각 튜브의 세칼 함량에 추가하는 덱스트로스 수의 양을 계산하려면 밀리리터당 밀리그램으로 원하는 농도로 튜브내 의 세칼 함량의 무게를 나눕니다. 세칼 내용물의 재정지를 위해 덱스트로스 물의 알리쿼트가 얼음 위에 보관하십시오. 세칼 함량을 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 필요한 양의 덱스트로스 물을 추가합니다.
튜브를 수직 및 수평으로 약 30초 동안 소용돌이시다. 직경이 몇 밀리미터 이상 미립자의 존재를 관찰하고, 존재하는 경우, 모든 미립자가 눈에 띄게 사라질 때까지 소용돌이를 계속합니다. 50 밀리리터 원심분리기를 얼음 위에 놓고 여과물을 수집하고 멸균 70 마이크로미터 세포 여과기를 위에 설치합니다.
파이펫 4 밀리리터는 세포 스트레이너를 통해 수집 튜브에 15 밀리리터 튜브에서 다시 중단 된 슬러리. 2~3회 위아래로 피펫을 하여 미립자를 다시 중단합니다. 더 이상 액체가 여과되지 않을 때까지 파이펫 끝으로 내용을 교반하는 동안 부드럽게 거품을 돌출하여 필터링 속도를 증가시킵니다.
이 정도는 약 30초가 소요됩니다. 세칼 슬러리의 각 튜브 사이에 세포 스트레이너를 변경하지만 모든 내용내용을 동일한 50 밀리리터 수집 튜브로 풀을 냅니다. 재고가 40 밀리리터를 초과하면 15초 동안 소용돌이를 가하고 20밀리리터를 새로운 원심분리기 튜브에 넣습니다.
슬러리를 각각 500 마이크로리터 알리코의 극저온 바이알로 나눕니다. 세 개의 바이알 마다 슬러리를 소용돌이. 얼음에 바이알에 마스터 스톡을 유지합니다.
알리쿼트를 마이너스 80에 저장함으로써, 세칼 슬러리 제제에 에어로빅 콜로니 형성 단위 농도는 6개월 동안 변하지 않는다. 이제 세칼 슬러리가 준비되었으므로, 우리는 체중 조절 용량의 세칼 슬러리로 7~8일 된 쥐의 쓰레기에 도전하는 데 사용할 수 있습니다. 슬러리의 치사성은 복용량에 따라 달라집니다.
새로운 용량 적정으로 모든 새로운 주식에 대한 시설에서 원하는 치명적인 복용량을 결정해야합니다. 1 개의 세칼 슬러리 주입 알리쿼트는 쓰레기 당 준비됩니다. 우리는 100 마이크로 리터 부피로 접종을 정상화하고, 쓰레기에 있는 각 동물에 대해 가장 가까운 10 마이크로 리터로 반올림합니다.
도전 알리쿼트에 도전 을 준비하는 것은 세 가지 계산이 필요합니다, 필요한 슬러리 재고의 볼륨, 덱스트로스 물의 추가 볼륨, 그리고 쓰레기의 각 새끼에 대한 둥근 볼륨. 각 계산을 수행하는 방법에 대한 세부 정보는 프로토콜의 섹션 3에서 찾을 수 있습니다. 모든 실험에 대해 이러한 계산을 수행하면 시간이 많이 소요될 수 있으며 실험 오류에 기여할 수 있으므로 스프레드시트는 재고 농도, 원하는 용량 및 쓰레기의 무게를 입력하는 프로토콜과 함께 다운로드할 수 있으며 슬러리 재고의 양, 덱스트로스 워터의 양 및 새끼 당 실제 볼륨이 자동으로 반환됩니다.
이 시트를 인쇄하고 동물에 도전할 준비가 되면 함께 가져갈 수 있습니다. 생물학적 안전 캐비닛에 주사 알리쿼트를 준비하고 얼음위에 보관하십시오. 주사기를 로드하기 전에 마이크로 센심 분리기 튜브를 20 번 가볍게 섞습니다.
새끼는 28 게이지 인슐린 주사기로 도전한다. 슬러리를 그리기 전에, 영감을 하고 마이크로 센심 분리기 튜브 안팎에서 도전 알리쿼트의 300 ~ 500 마이크로 리터를 배출하여 알리쿼트를 혼합합니다. 그런 다음, 도전 알리 쿼트의 약 150 마이크로 리터를 그립니다.
이것은 어떤 7 8 일 오래 된 강아지에 대 한 주사 볼륨 보다 더 큰 해야 합니다. 주사기를 쓸어 떨어 세면에서 플런저에서 거품을 빼내고 주사기에 약간 다시 그려기 위해 기포를 추방합니다. 이 과정에서 바늘이나 플런저 샤프트를 만지지 마십시오.
마우스에 대한 계산된 양의 세칼 슬러리가 주사기에 로드될 때까지 과량의 세칼 슬러리를 마이크로센심분리기 튜브에 다시 분배합니다. 세칼 슬러리는 복막 주사로 투여된다. 동물 보호 기관의 프로토콜에 따라 수행하십시오.
누출을 최소화하기 위해 새끼를 아래쪽으로 기울여 다리와 생식기 사이에 바늘을 삽입하여 바늘을 얕고 피하상태로 유지합니다. 약 1센티미터에 대한 바늘을 삽입 한 후, 바늘이 심폐 소에 구멍을 느낄 때까지 아래쪽으로 누르고 앞으로, 다음 천천히 플런저를 우울. 당신이 들어갔을 때와 같은 경로를 따라 조심스럽게 바늘을 철회하고, 당신이 그렇게할 때 가운데 손가락을 이완시하십시오.
실험실 노트북의 누출을 기록하고 최종 결과에서 상당한 누출이있는 동물을 생략하는 것이 좋습니다. 이 섹션에서 우리는 우리가 다편성 패혈증과 그들의 해당 인도적인 끝점으로 도전마우스에서 관찰하는 건강의 다른 수준을 설명합니다. 신생아 마우스와 관련된 모든 절차에 대해 침구 재료를 새 케이지로 옮기습니다.
이것은 당신의 장갑에 여자의 냄새를 전송하고 그녀의 케이지에 반복 입력에서 여자의 스트레스를 줄일 수 있습니다. 우리는 새로운 케이지에 두 번째 둥지를 만들어 전체 쓰레기가 여자의 우리에 반환 할 준비가 될 때 절차 또는 모니터링이 끝날 때까지 모니터링 된 새끼를 개최합니다. 마우스를 뒷면에 놓고 4초 이내에 바로 사용할 수 있도록 모니터합니다.
맞을 수 있다면 8초 더 기다렸다가 이동성 수준을 결정합니다. 도전하지 않거나 복구하는 마우스는 여러 단계를 연속으로 수행하여 해당 환경을 바로 탐색할 수 있습니다. 자신을 바로 잡을 수있는 마우스를 다시 그룹화하고 권리 무기력으로 환경을 탐구하기 위해 몇 가지 단계를 수행.
이 마우스는 단계를 복용 하는 동안 넘어질 수 있습니다 하 고 그들의 발에 흔들리는 보이는. 오른쪽에서 우측할 수 없는 마우스는 수평으로부터 90도를 초과하는 엉덩이 움직임을 가지며, 우측 이동에 실패하여 그룹화합니다. 이 마우스는 결국 오른쪽으로 하지만 4 초 이내에 할 수 없습니다.
엉덩이 움직임 때문에 오른쪽 모바일에 실패로 그룹화됩니다. 오른쪽에서 오른쪽과 수평에서 90도 이하 엉덩이 움직임을 가지고 새끼는 오른쪽 무기력에 실패로 그룹화된다. 이것은 엉덩이가 수평에서 90도를 초과하지 않고 오른쪽 무기력에 실패로 그룹화되는 마우스의 또 다른 예입니다.
오른쪽 비 이동 강아지에 실패 흔들거나 진동 하지만 엉덩이 움직임이 없는 다리를 가질 것 이다. 사지는 연장및 후퇴할 수 있지만 측면 이동이 없습니다. 강아지는 눈에 띄게 아프고 인도적 종점에 도달했습니다.
이것은 오른쪽 비 모바일 강아지에 실패의 또 다른 예입니다. 엉덩이는 왼쪽에서 오른쪽으로 흔들리지 않지만 발은 진동합니다. 여자의 새장을 다룰 때, 새끼는 간호 여자가 실행하는 경우 둥지밖으로 드래그 할 수 있습니다.
우리는 이것을 교체한 다음 둥지 에서 멀리 떨어진 다른 흩어진 새끼를 확인합니다. 흩어진 새끼들이 무기력하게 맞지 않으면 인도적인 끝에 있습니다. 패혈증 모델의 카플란 마이어 서바이벌 곡선은 다음과 같습니다.
모니터링 시간 점은 연결된 SOP에서 찾을 수 있습니다. 마우스가 오른쪽 비 이동에 실패하는 것으로 판명되면 생존 곡선을 따라 어느 시점에서, 그것은 인도적 종점에 안락사. 12 시간에서 21 시간 사이, 마우스는 아프게 나타나고 마우스의 대략 반은 한쪽에 바로 수 있을 것입니다, 다른 반은 그들의 측의 양쪽에 바로 실패하는 동안.
이것은 마우스가 건강 점수에 있는 digress를 시작하고 오른쪽 비 이동에 실패의 인도적인 종점에 도달하는 기간입니다. 이들은 이 기간에 관찰된 건강 점수의 대표적인 결과입니다. 생존자와 비 생존자 그룹은 건강 점수에 따라이 시점에서 차별화 할 수 없습니다.
질병의이 단계에서, 21 48 시간 도전 후, 우리는 인도적 종점의 가장 높은 비율을 관찰. 우리는 또한 양측에 바로 잡을 수 없는 마우스의 대다수가 질병에서 회복되지 않을 것이라는 점을 관찰했습니다, 따라서 오른쪽 비이동 기준에 실패 이외에 인도적인 종점에 대한 새로운 기준이 됩니다. 질병의이 단계에서 관찰 된 건강 점수는 비 생존자에서 생존자의 분리 결과.
양쪽에서 바로 할 수없는 마우스의 대다수는 질병에서 회복되지 않았다. 이 데이터는 도전 후 21시간부터 시작되는 인도적 종말점에 대한 새로운 기준이 양측모두에 제대로 맞지 않는 모든 쥐를 안락사시키는 것이어야 한다는 것을 뒷받침합니다. 48 시간 이상 도전 후 많은 마우스는 더 많은 활동과 더 나은 오른쪽 반사를 표시하기 시작합니다.
인도적 종점의 비율이 이 기간에 더 낮더라도, 마우스는 아직도 더 이상 파고 들고 아프게 될 수 있고, 인간적인 끝점에 대한 감시가 필요합니다. 이 기간 동안, 결국 비 생존자로 그룹화 된 그 마우스중 일부는 한 지점에서 증가 활동을 표시했지만 나중에 악화하고 인도적 종점에 도달했습니다. 이것은 더 나쁜 건강 결과를 표시하기 시작하면 증가된 주파수를 가진 아픈 동물의 지속적인 감시를 필요로 합니다.
대면 교육을 받지 못하고 이 교육 용 비디오만 관찰한 독립 실험자는 녹화된 테스트 비디오를 사용하여 조사자와 동일한 점수를 할당하는 능력으로 테스트되었습니다. 이 교육 비디오는 정확한 행동 분류를 초래합니다. 인도적 종점의 척도인 오른쪽 비이동 신생아 마우스에 실패하는 올바른 점수를 할당하는 능력은 60마리의 신생아 마우스 중에서 결정되었으며, 평균 97%의 행동이 정확하게 구별되었으며, 3%만이 잘못 식별되었다.
다음으로, 오른쪽에 실패하거나 4초 이내에 바로 할 수 있었던 신생아 마우스를 구별하는 능력이 시험되었다. 이것은 인도적인 끝점의 또 다른 측정이고 정확하게 신생아 마우스의 97%에 할당된 반면, 새끼의 3%는 권리로 잘못 할당되었습니다. 다음은 도전 의 시간에 비해 마우스의 퍼센트 체중 변화에 대한 대표적인 결과입니다.
생존자와 비 생존자 사이의 평균 체중 변화는 도전 후 24 시간에서 분리되기 시작했지만 그룹 사이에는 많은 중복이 있습니다. 20% 이상 체중을 잃었지만 여전히 질병에서 회복된 생존자도 있었습니다. 체중 변화는 마우스가 인도적 종점에 있는지 여부를 결정하는 기준으로 사용되지 않는 이유인 건강 점수의 차이와 비교하여 결과를 예측하는 데 효율적이지 않았습니다.
결론을 내리기 위해, 당신은 지금 냉동 세칼 슬러리의 주식을 준비 할 수 있어야합니다, 무게 조정 복용량을 계산. 그리고 인간적인 끝점에 대한 신생아 마우스를 주입하고 모니터링합니다. 우리는이것이 당신의 마우스 연구를위한 귀중한 자원이 될 수 있기를 바랍니다.
