Shalom.Il BW Reporter System consente di studiare le interazioni recettore-ligando. È estremamente utile nei casi in cui il ligando di uno specifico recettore è sconosciuto o nei casi in cui gli esperimenti con il ligando endogeno sono tecnicamente difficili. Questo metodo è sensibile e specifico per un singolo recettore, facile da usare e riproducibile.
A dimostrare la procedura sarà Shira Kahlon, un postdoc per il mio laboratorio. Il giorno prima della trasfezione, placcare 10 piastre con 10 millilitri di 100.000 cellule BW5147 e integrare un RPMI. Quindi posizionare 100 microgrammi del plasmide pcDNA3 in un tubo.
Aggiungere l'acetato di sodio a pH 5.3 al tubo. Successivamente, aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% alla miscela plasmide. Quindi incubare la miscela plasmide durante la notte a meno 20 gradi Celsius.
24 ore dopo aver placcato le cellule BW, raccogliere le cellule in due tubi da 50 millilitri. Quindi centrifugare le cellule a 515 g per cinque minuti e scartare il supernatante. Rimospend il gruppo RPMI senza aggiunte e ripetere la centrifugazione.
Resuspend il pellet risultante in 1 millilitro di RPMI senza aggiunte. Trasferire il pellet rimorsio in una cuvata di 4 centimetri sul ghiaccio. Centrifugare il plasmide che ha subito precipitazioni di etanolo.
Quindi lavare il plasmide con un millilitro di 70% di etanolo. E ripetere la centrifugazione per altri 20 minuti. Rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare parzialmente il pellet.
Quindi rimescolare il pellet in 100 microlitri di RPMI preriscaldato, senza aggiunte. Dopo questo, aggiungere il plasmide rimorsidito alle cellule in coccola. Incubare le cellule sul ghiaccio per cinque minuti.
Quindi, elettroporate le cellule. Quindi trasferire le celle elettroporate in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 50 millilitri di mezzo completo al tubo e centrifugare per cinque minuti, a 515 g.
Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 50 millilitri di mezzo completo. Quindi placcare le cellule in piatti di coltura di 24 pozzi e incubare le cellule per 48 ore. Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo completo, integrato con 10 milligrammi per millilitro di G418 ad ogni pozzo.
48 ore dopo, scartare un millilitro del volume superiore di ogni pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo completo integrato con cinque milligrammi per millilitro di G418 ad ogni pozzo. Utilizzare 50.000 cellule BW trasfette con i bersagli desiderati, in un unico pozzo di una piastra da 96 po'.
Incubare la piastra per 48 ore. Quindi congelare la piastra a meno 20 gradi Celsius. Rivestire una piastra ELISA con anticorpo IL-2 anti-topo.
Posizionare 05 microgrammi di IL-2 anti-mouse, in un volume di 50 microlitri di PBS in ogni pozzo. Incubare la piastra rivestita durante la notte a quattro gradi Celsius. Utilizzare un breve periodo di incubazione a 37 gradi Celsius, per scongelare le cellule BW congelate, precedentemente incubate con i loro bersagli.
Quindi centrifugare la piastra e trasferire 100 microlitri del supernatante da ogni pozzo alla piastra ELISA pre-rivestita. E incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo questo aggiungere biotina anti-mouse IL-2 alla piastra ELISA.
Quindi, dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere la streptavidina coniugata HRP al piatto. Dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato TMB, ad ogni pozzo della piastra ELISA. Leggi infine la piastra ELISA a 650 nanometri.
In questo esempio, le cellule CLL sono state pre-incubate con diversi anticorpi anti-CD20. E poi co-incubato con cellule BW trasfette che esprimono i recettori Fc CD16, prima di essere analizzato con ELISA. Dopo l'analisi con ELISA i risultati sono stati quantificati.
I livelli di densità ottica, sono stati convertiti in concentrazioni il-2 del mouse, in base alla curva standard. In un esperimento aggiuntivo, diverse dosi di anticorpi anti-CD20 sono state pre-incubate con cellule CLL. E poi incubato con le cellule BW trasfette.
La particella contiene quattro parti principali. Clonazione, trasfezione di cellule BW, attivazione ed ELISA. Ognuna delle parti deve essere verificata in modo indipendente.
Seguendo questa procedura, ulteriori esperimenti possono essere eseguiti con cellule che esprimono i recettori endogeni, come uccidere gli acidi con cellule NK per studiare le interazioni con i recettori cellulari NK. Abbiamo usato questo sistema per scoprire nuovi ligandi dei recettori cellulari NK. Per esempio, l'emagglutinina è un ligando di NKp46, e PVL è un ligando di TG.
