Shalom.The BW Reporter System permite estudiar las interacciones receptor-ligand. Es extremadamente útil en casos donde el ligando de un receptor específico es desconocido o en casos donde los experimentos con el ligando endógeno son técnicamente difíciles. Este método es sensible y específico para un receptor individual, fácil de operar y reproducible.
Demostrando el procedimiento estará Shira Kahlon, un postdoctorado para mi laboratorio. El día antes de la transfección, placa 10 placas con 10 mililitros de 100, 000 células BW5147, y complementar una RPMI. A continuación, coloque 100 microgramos del plásmido pcDNA3 en un tubo.
Añadir acetato de sodio a pH 5.3 al tubo. Después de esto, añadir 2,5 volúmenes de 100% etanol a la mezcla de plásmido. Luego incubar la mezcla de plásmido durante la noche a menos 20 grados centígrados.
24 horas después de enchapar las células BW, recoger las células en dos tubos de 50 mililitros. Luego centrifuga las células a 515 g durante cinco minutos, y deseche el sobrenadante. Resuspender la RPMI del pelotón sin adiciones y repetir la centrifugación.
Resuspender el pellet resultante en 1 mililitro de RPMI sin adiciones. Transfiera el pellet resuspendido a una cubeta de 4 centímetros sobre hielo. Centrifugar el plásmido que sufrió precipitación de etanol.
A continuación, lave el plásmido con un mililitro de 70% de etanol. Y repite la centrifugación por otros 20 minutos. Retire todo el etanol y deje que el pellet se seque parcialmente.
A continuación, resuspender el pellet en 100 microlitros de RPMI precalentado, sin adiciones. Después de esto, agregue el plásmido resuspendido a las células en la cubeta. Incubar las células sobre hielo durante cinco minutos.
A continuación, electropogrape las células. Luego transfiera las células electroporadas a un tubo de 50 mililitros. Añadir 50 mililitros de medio completo al tubo y centrifugar durante cinco minutos, a 515 g.
Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 50 mililitros de medio completo. Luego plato las células en platos de cultivo de 24 pozos, e incubar las células durante 48 horas. Después de esto, añadir un mililitro de medio completo, complementado con 10 miligramos por mililitro de G418 a cada pozo.
48 horas más tarde, deseche un mililitro del volumen superior de cada pozo. A continuación, añadir un mililitro de medio completo complementado con cinco miligramos por mililitro de G418 a cada pozo. Utilice 50.000 células BW transfectados con sus objetivos deseados, en un solo pozo de una placa de 96 pozos.
Incubar el plato durante 48 horas. A continuación, congele la placa a menos 20 grados centígrados. Recubrir una placa ELISA con anticuerpos antiratón IL-2.
Coloque 05 microgramos de IL-ratón antiratón, en un volumen de 50 microlitros de PBS en cada pozo. Incubar la placa recubierta durante la noche a cuatro grados centígrados. Utilice un breve período de incubación a 37 grados centígrados para descongelar las células BW congeladas, que previamente fueron incubadas con sus objetivos.
A continuación, centrifugar la placa, y transferir 100 microlitros del sobrenadante de cada pozo a la placa ELISA pre-recubierta. Y incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de esto añadir biotina anti-ratón IL-2 a la placa ELISA.
Después de la incubación y el lavado, agregue la estreptavidina conjugada con HRP al plato. Después de la incubación y lavado, añadir 100 microlitros de la solución de sustrato TMB, a cada pocillo de la placa ELISA. Finalmente lea la placa ELISA a 650 nanómetros.
En este ejemplo, las células CLL se pre-incubaron con diferentes anticuerpos anti-CD20. Y luego co-incubado con células BW transfectadas que expresan los receptores Fc CD16, antes de ser analizado con ELISA. Después del análisis con ELISA se cuantificaron los resultados.
Los niveles de densidad óptica, se convirtieron en concentraciones il-2 de ratón, basados en la curva estándar. En un experimento adicional, se pre-incubaron diferentes dosis de anticuerpos anti-CD20 con células CLL. Y luego incubado con las células BW transfectadas.
La partícula contiene cuatro partes principales. Clonación, transfección de células BW, activación y ELISA. Cada una de las piezas debe verificarse de forma independiente.
Después de este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales con células que expresan los receptores endógenos, como matar ácidos con células NK para estudiar las interacciones con receptores de células NK. Hemos utilizado este sistema para descubrir nuevos ligandos de receptores celulares NK. Por ejemplo, la hemaglutinina es un ligando de NKp46, y PVL es un ligando de TG.
