Shalom.O BW Reporter System permite estudar interações receptor-ligantes. É extremamente útil nos casos em que o ligante de um receptor específico é desconhecido ou nos casos em que os experimentos com o ligante endógeno são tecnicamente difíceis. Este método é sensível e específico para um receptor individual, fácil de operar e reprodutível.
Demonstrando o procedimento será Shira Kahlon, um pós-doutor para o meu laboratório. Um dia antes da transfecção, placa 10 placas com 10 mililitros de 100.000 células BW5147, e complementar um RPMI. Em seguida, coloque 100 microgramas do plasmídeo pcDNA3 em um tubo.
Adicione acetato de sódio no pH 5.3 ao tubo. Depois disso, adicione 2,5 volumes de 100% de etanol à mistura plasmida. Em seguida, incubar a mistura plasmida durante a noite a menos 20 graus Celsius.
24 horas depois de emplacar as células BW, colete as células em dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar as células a 515 g's por cinco minutos, e descartar o supernasce. Resuspenque o pelotão RPMI sem adições e repita a centrifugação.
Resuspende a pelota resultante em 1 mililitro de RPMI sem adições. Transfira a pelota resuspended para uma pepa de 4 centímetros no gelo. Centrifugar o plasmídeo que sofreu precipitação de etanol.
Em seguida, lave o plasmídeo com um mililitro de 70% de etanol. E repita a centrifugação por mais 20 minutos. Retire todo o etanol e deixe a pelota secar parcialmente.
Em seguida, resuspenque a pelota em 100 microliters de RPMI pré-aquecido, sem adições. Depois disso, adicione o plasmídeo resuspended às células em cuvet. Incubar as células no gelo por cinco minutos.
Em seguida, eletroporar as células. Em seguida, transfira as células eletroporadas para um tubo de 50 mililitros. Adicione 50 mililitros de meio completo ao tubo e centrífuga por cinco minutos, a 515 g's.
Descarte o supernasce e resuspenque as células em 50 mililitros de meio completo. Em seguida, emplaque as células em 24 pratos de cultura, e incubar as células por 48 horas. Depois disso, adicione um mililitro de meio completo, suplementado com 10 miligramas por mililitro de G418 para cada poço.
48 horas depois, descarte um mililitro do volume superior de cada poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo suplementado com cinco miligramas por mililitro de G418 para cada poço. Use 50.000 células BW transfeinadas com seus alvos desejados, em um único poço de uma placa de 96 poços.
Incubar a placa por 48 horas. Em seguida, congele a placa a menos 20 graus Celsius. Cubra uma placa ELISA com anticorpo IL-2 anti-rato.
Coloque 05 microgramas de IL-2 anti-rato, em um volume de 50 microliters de PBS em cada poço. Incubar a placa revestida durante a noite a quatro graus Celsius. Use um breve período de incubação a 37 graus Celsius, para descongelar as células BW congeladas, que foram previamente incubadas com seus alvos.
Em seguida, centrifufique a placa e transfira 100 microliters do supernante de cada poço para a placa ELISA pré-revestida. E incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Depois disso, adicione biotina anti-rato IL-2 à placa ELISA.
Em seguida, após a incubação e lavagem, adicione o streptavidin conjugado hrp à placa. Após a incubação e lavagem, adicione 100 microliters da solução de substrato TMB, a cada poço da placa ELISA. Por fim, leia a placa ELISA em 650 nanômetros.
Neste exemplo, as células LLC foram pré-incubadas com diferentes anticorpos anti-CD20. E então co-incubado com células BW transfectadas que expressam os receptores Fc CD16, antes de serem analisados com ELISA. Após análise com ELISA os resultados foram quantificados.
Os níveis de densidade óptica foram convertidos em concentrações de IL-2 do mouse, com base na curva padrão. Em um experimento adicional, diferentes doses de anticorpos anti-CD20 foram pré-incubadas com células LLC. E então incubado com as células BW transfeinadas.
A partícula contém quatro partes principais. Clonagem, transfecção de células BW, ativação e ELISA. Cada uma das peças deve ser verificada independentemente.
Após esse procedimento, experimentos adicionais podem ser realizados com células que expressam os receptores endógenos, como matar ácidos com células NK para estudar interações com receptores de células NK. Usamos este sistema para descobrir novos ligantes de receptores de células NK. Por exemplo, hemagglutinina é um ligante de NKp46, e PVL é um ligante de TG.
