Shalom.BW 리포터 시스템은 수용체 리간드 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 특정 수용체의 리간드가 알려지지 않았거나 내인성 리간드를 가진 실험이 기술적으로 어려운 경우에 매우 유용합니다. 이 방법은 민감하고 개별 수용체에 특정, 작동하기 쉽고 재현 할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 독인 시라 칼론이 될 것입니다. 전날, 100, 000 BW5147 셀의 10 밀리리터가 있는 10개의 플레이트를 플레이트하고 RPMI를 보충합니다. 그런 다음 튜브에 pcDNA3 플라스미드의 100 마이크로그램을 놓습니다.
관에 pH 5.3에서 아세테이트 나트륨을 추가합니다. 그 후, 플라스미드 혼합물에 100%에탄올의 2.5부량을 추가한다. 그런 다음 밤새 플라스미드 혼합물을 영하 20도에서 배양합니다.
BW 세포를 도금한 후 24시간 후, 2개의 50 밀리리터 튜브에서 세포를 수집합니다. 그런 다음 515 g의 세포를 5분간 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. 펠로톤 RPMI를 추가하지 않고 다시 중단하고 원심분리를 반복합니다.
추가없이 RPMI의 1 밀리리터에서 결과 펠릿을 다시 중단합니다. 재매달된 펠릿을 얼음 위에 4센티미터 커벳으로 옮기습니다. 에탄올 강수량을 겪은 플라스미드원심분리.
그런 다음 플라스미드를 70%에탄올 1밀리리터로 씻습니다. 그리고 또 다른 20 분 동안 원심 분리를 반복합니다. 에탄올을 모두 제거하고 펠릿이 부분적으로 건조되도록 합니다.
그런 다음 추가없이 예열 된 RPMI의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 이 후, 커벳의 세포에 다시 중단 된 플라스미드를 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 세포를 배양.
다음으로, 세포를 전기화합니다. 그런 다음 전기 소세포를 50 밀리리터 튜브로 이송합니다. 515g에서 5분간 튜브와 원심분리기에 50밀리리터의 완전한 매체를 추가합니다.
상체를 버리고 완전한 배지의 50 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음 세포를 24웰 배양 접시에 넣고 48시간 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 전체 매체의 1 밀리 리터를 추가, 보충 10 각 잘 G418의 밀리 리터 당 밀리 그램.
48 시간 후, 각 우물의 상부 량의 1 밀리리터를 폐기하십시오. 그런 다음 G418의 밀리리터 당 5 밀리그램으로 보충된 완전한 중간 크기의 밀리리터 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 원하는 표적을 가진 50, 000의 전감염된 BW 세포를 96웰 플레이트의 단일 우물에서 사용하십시오.
접시를 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 접시를 영하 20도에서 동결합니다. 항 마우스 IL-2 항체로 ELISA 플레이트를 코팅합니다.
각 우물에 PBS의 50 마이크로 리터의 부피에, 안티 마우스 IL-2의 05 마이크로 그램을 배치합니다. 코팅 된 접시를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이전에 표적으로 배양되었던 냉동 BW 세포를 해동하기 위하여, 섭씨 37도에서 잠깐 잠복기를 사용합니다.
그런 다음 플레이트원심분리하고, 상퍼의 100 마이크로리터를 각 웰에서 미리 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기다. 그리고 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 이 후 ELISA 플레이트에 비오틴 항 마우스 IL-2를 추가합니다.
그런 다음 인큐베이션 및 세척 후 HRP 공액 스트렙타비딘을 접시에 추가합니다. 인큐베이션 및 세척 후, ELISA 플레이트의 각 웰에 TMB 기판 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로 650 나노 미터에서 ELISA 플레이트를 읽으십시오.
이 예에서, CLL 세포는 상이한 반대로 CD20 항체로 사전 배양되었다. 그리고 ELISA와 분석되기 전에 Fc 수용체 CD16을 발현하는 전감염된 BW 세포와 공동 배양하였다. ELISA를 분석한 후 결과는 정량화되었다.
광학 밀도 수준은 표준 곡선을 기반으로 마우스 IL-2 농도로 변환되었다. 추가 실험에서, 항 CD20 항체의 다른 복용량은 CLL 세포로 사전 배양되었다. 그리고 그 때 전감염된 BW 세포로 배양하였다.
파티클에는 네 개의 주요 부품이 포함되어 있습니다. 복제, BW 세포의 트랜스퍼링, 활성화 및 ELISA. 각 부품은 독립적으로 확인해야 합니다.
이 절차에 따라 NK 세포수용체와의 상호 작용을 연구하기 위해 NK 세포와 산을 죽이는 것과 같은 내인성 수용체를 발현하는 세포로 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 우리는 NK 세포 수용체의 새로운 리간드를 발견하기 위해이 시스템을 사용했다. 예를 들어, 헤마글루티닌은 NKp46의 리간드이며, PVL은 TG의 리간드이다.
