الهدف العام لهذا الإجراء هو تقييم في المختبر ، وتأثير الكمون عكس العوامل على معالجة فيروس نقص المناعة الرنا. ويوفر البروتوكول طريقة بسيطة فعالة وموثوقة لتقييم أثر جيش الرب للمقاومة في آن واحد على النسخ والتشبيك بين فيروس نقص المناعة البشرية. وقد وفرت هذه التقنية فكرة عن قدرة الوكالات غير الإقليمية على الحث على إعادة تنشيط الفيروس وإزالة المكامن الكامنة.
بعد زراعة الخلايا، مكان 20،000 منهم في 100 ميكرولترات من المتوسط DMEM، تستكمل مع 10٪ FBS، ودون المضادات الحيوية في آبار 96 جيدا لوحة مسطحة أسفل لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي تمييع بناء مراسل مزدوجة اللون. تات والقس الحمض النووي في 50 ميكرولترات من مصل المتوسطة الحرة، ومزيج بلطف.
خلط بلطف مُكشف الدهون، ثم قم بتخفيف 0.65 ميكرولترات منه لكل رد فعل في 50 ميكرولترات من الوسيلة الحرة في المصل. اخلطي بلطف، وحضني في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الجمع بين مُكشف الدهون المخفف مع الحمض النووي المخفف وخلط بلطف.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم، الاستغناء 100 ميكرولترات من هذا الحمض النووي مُكْدَر الدهون المعقدة إسقاط الحكمة، على رأس الخلايا في كل بئر. صخرة لوحة بلطف ذهابا وإيابا لخلط.
واحتضان لوحة في حاضنة مرطبة، في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. بعد ذلك، transfect آبار إضافية مع 100 نانوغرام من CMV مدفوعة EGFP وDSRed صريحة الحمض النووي plasmid لأغراض التعويض. للبدء، تمييع كل عامل عكس زمن الوصول إلى حالة العمل المناسبة مع متوسط النمو.
باستخدام رئيس أنبوب متعدد القنوات، تعرق بعناية وسيط transfection، واستبدالها مع 100 ميكرولترات من المتوسطة التي تحتوي على عامل عكس الكمون المناسب. احتضان في حاضنة مرطبة بنسبة 37٪ مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. للبدء في تلطيخ الخلايا، استخدم رأس أنبوب متعدد القنوات لإضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
بلطف أنبوب الرأس صعودا وهبوطا ما يقرب من خمس مرات. مع التأكد من تجنب زبد لفصل الخلايا في وسائل الإعلام. بعد ذلك، نقل الخلايا إلى آبار لوحة V-القاع 96-جيدا.
جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. التعرق المتوسطة وبرنامج تلفزيوني دون لمس الخلايا. غسل الخلايا مرة واحدة على الأقل مع 200 ميكرولترات من البروتين والمصل برنامج تلفزيوني مجاني.
جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إمالة لوحة لتجاهل افرحة وإزالة العازلة غسل دون لمس الخلايا. بعد هذا تمييع صبغة قابلة للحياة الثابتة في البروتين والمصل برنامج تلفزيوني مجانا بنسبة 1 إلى 1000، لإعداد حل العمل.
إضافة 50 ميكرولترات من صبغة مخففة لكل بئر، ورأس الأنابيب صعودا وهبوطا لخلط. احتضان أربع درجات مئوية. بينما محمية من الضوء باستخدام احباط لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
ثم غسل الخلايا مرة أو مرتين مع 150 ميكرولترات من العازلة الغسيل. بعد ذلك، الطرد المركزي في 500 مرة الجاذبية، وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من فائقة. لإصلاح الخلايا، إضافة 100 ميكرولترات من الطازجة 1٪ الفورمالديهايد وغسل العازلة.
واحتضان في أربع درجات مئوية في حين محمية من الضوء لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا مرة أو مرتين بـ 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل. جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تجاهل supernatant، وإعادة فرض بيليه الخلية في 70 ميكرولترات من العازلة الغسيل. بعد التحقق من أداء إعدادات مقياس الحساسية من خلال تشغيل حبات المعايرة ، قم بضبط الفولتية الأمامية والجانبية المبعثرة مع عينة غير ملوثة ، بحيث يكون السكان الرئيسيون على الشاشة ويمكن تمييزه بوضوح. تنفيذ تعويض يدوي أو تلقائي باستخدام عينات واحدة ملطخة، وضمان الحد الأدنى من تسرب على عدد من السكان إيجابية EGFP في كاشف DsRed والعكس بالعكس.
باستخدام الفلوريسنس ناقص واحد الضوابط، وخلق المؤامرات وتعيين البوابات. بعد ذلك، ضبط الفولتية إلى الأمام والجانب مبعثر مع عينة غير المطّع، بحيث السكان الرئيسيين على الشاشة ويمكن تمييزها بوضوح. الحصول على وتسجيل الحد الأدنى من 10،000 أحداث خلية قابلة للحياة لكل عينة.
بعد ذلك، استخدم برنامج تحليل بيانات قياس التدفق لتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. النتائج التمثيلية للتعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية-1، غير منزّع وspliced المنتجات، بعد العلاج مع مثبطات برومدومين JQ1، تبين أن كلا من JQ1 إيجابية وتات، زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن EGFP. وهو ما يدل على النصوص غير المُغَلّى.
كما ينظر إلى JQ1 إيجابية لزيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن DsRed. وزيادة نسبة المنتج المُزَمَر إلى مستويات مماثلة مثل تات. وهذا يؤكد قدرة JQ1 إيجابية لتشغيل النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والتشبيك.
ومع ذلك، العلاج مع التحكم في النظائر المجسمة JQ1 سلبية، يلغي تأثير إيجابي JQ1 على النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والتشبيك. مرة واحدة يتقن, يمكن تنفيذ هذه الطريقة باستخدام المخدرات بشكل فردي أو في تركيبة. اختبار لقدرتها على التآزر بكفاءة.
مما يؤدي إلى جرعة أقل من الدواء والسمية. بعد كل تطور، مهدت هذه التقنية الطريق لاختبار تركيبات الأدوية الفعالة في النماذج الأولية من الكمون في عينات المرضى الذين يعانون من نقص في الجسم.
