El objetivo general de este procedimiento es evaluar in vitro, el impacto de los agentes que revierten la latencia en el procesamiento del ARNm del VIH. El protocolo proporciona un método simple y fiable para evaluar, simultáneamente el efecto del LRA en la transcripción y el empalme del VIH. Esta técnica proporcionó una idea de la capacidad de los LDA para inducir la reactivación del virus y el aclaramiento del reservorio latente.
Después de cultivar las células, colocar 20.000 de ellas en 100 microlitros de DMEM medio, complementado con 10%FBS, y sin antibióticos en los pozos de una placa inferior plana de 96 pozos durante 24 horas. Al día siguiente diluir la construcción del reportero de doble color. ADN de Tat y Rev en 50 microlitros de medio libre de suero, y mezclar suavemente.
Mezclar suavemente el reactivo lipídico y luego diluir 0,65 microlitros del que se filtra por reacción en 50 microlitros de medio libre de suero. Mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Combine el reactivo lipídico diluido con el ADN diluido y mezcle suavemente.
Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, dispensar 100 microlitros de este complejo de ADN de reactivo de lípidos gota sabia, en la parte superior de las células en cada pozo. Mece suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para mezclar.
E incubar la placa en una incubadora humidificada, a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de esto, transfectar pozos adicionales con 100 nanogramos de EGFP impulsado por CMV y plásmido de ADN exprés DsRed para fines de compensación. Para comenzar, diluya cada agente de inversión de latencia a la condición de trabajo adecuada con el medio de crecimiento.
Con un cabezal de tubería multicanal, aspire cuidadosamente el medio de transfección y sustitúyalo por 100 microlitros de medio que contengan el agente de inversión de latencia adecuado. Incubar en una incubadora humidificada a 37% celsius con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Para comenzar a tinr las células, utilice un cabezal de tubería multicanal para agregar 100 microlitros de PBS a cada pozo.
Suavemente la cabeza de la tubería hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces. Mientras se asegura de evitar la espuma para separar las células en los medios. A continuación, transfiera las células a los pozos de una placa inferior en V de 96 pozos.
Centrifugar a 500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar el medio y el PBS sin tocar las células. Lavar las células al menos una vez con 200 microlitros de proteínas y PBS libres de suero.
Centrifugar a 500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Incline la placa para desechar el sobrenadante y retire el tampón de lavado sin tocar las células. Después de esto diluir el tinte de viabilidad fija en PBS libre de proteínas y suero en una proporción de 1 a 1000, para preparar una solución de trabajo.
Agregue 50 microlitros del tinte diluido a cada pozo, y la cabeza de la tubería hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar a cuatro grados centígrados. Mientras esté protegido de la luz usando papel de aluminio durante 10 a 15 minutos.
Luego lave las células una o dos veces con 150 microlitros de tampón de lavado. Después de esto, centrifugar a 500 veces la gravedad, y cuatro grados celsius durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Para fijar las células, agregue 100 microlitros de 1% de formaldehído recién preparado y tampón de lavado.
E incubar a cuatro grados centígrados mientras está protegido de la luz durante 10 a 15 minutos. Después de esto, lave las células una o dos veces con 100 microlitros de tampón de lavado. Centrifugar a 500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 70 microlitros de tampón de lavado. Después de comprobar el rendimiento y la sensibilidad de los ajustes del citómetro mediante la ejecución de perlas de calibración, ajuste los voltajes de dispersión hacia delante y lateral con la muestra no manchada, de modo que la población principal esté en pantalla y claramente discernible. Realice una compensación manual o automática utilizando las muestras de una sola mancha, asegurando un derrame mínimo sobre la población positiva de EGFP en el detector DsRed y viceversa.
Usando la fluorescencia menos uno controles, cree trazados y establezca las puertas. A continuación, ajuste los voltajes de dispersión hacia adelante y hacia el lado con la muestra no mantenida, de modo que la población principal esté en pantalla y claramente discernible. Adquiera y registre un mínimo de 10.000 eventos celulares viables por muestra.
Después de esto, utilice el software de análisis de datos de citometría de flujo para analizar los datos como se describe en el protocolo de texto. Los resultados representativos de la expresión del VIH-1, los productos sin empalme y empalmados, después del tratamiento con el inhibidor del bromodomain JQ1, muestran que tanto JQ1 positivo como Tat, aumentan significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP. Lo cual es indicativo de transcripciones sin empalmar.
JQ1 positivo también se considera que aumenta significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed. Y aumentar la proporción de producto empalmado a niveles similares como Tat. Esto confirma la capacidad de JQ1 positivo para activar la transcripción y el empalme del VIH.
Sin embargo, el tratamiento con un control estereoisómero JQ1 negativo, abolió el efecto positivo JQ1 en la transcripción y el empalme del VIH. Una vez masterado, este método se puede llevar a cabo utilizando drogas individualmente o en combinación. Pruebas para su capacidad de sinergizar eficientemente.
Lo que llevaría a una dosis más baja de la droga y toxicidad. Después de cada desarrollo, esta técnica allanó el camino para probar combinaciones de fármacos eficientes en modelos primarios de latencia en muestras de pacientes ex vivos.
