Bu prosedürün genel amacı in vitro değerlendirmektir, GECIKME geri ajanlar HIV mRNA işleme üzerindeki etkisini. Protokol, aynı anda LRA'nın HIV transkripsiyon ve birleştirme üzerindeki etkisini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, LLA'ların virüs reaktivasyonu ve gizli rezervuarın temizlenmesini tetikleme yeteneği hakkında bir fikir verilmiştir.
Hücreleri yetiştirdikten sonra, 20, 000 tanesi 100 mikrolitre DMEM orta yerleştirin, 10% FBS ile desteklenen, ve 24 saat boyunca 96-iyi düz alt plaka kuyularında antibiyotik olmadan. Ertesi gün çift renkli muhabir inşa seyreltmek. Tat ve Rev DNA serum serbest orta 50 mikrolitre, ve yavaşça karıştırın.
Yağ reaktifini hafifçe karıştırın ve 50 mikrolitre serumsuz ortamda reaksiyon başına 0,65 mikrolitre seyreltin. Yavaşça karıştırın ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Seyreltilmiş lipid reaktifini seyreltilmiş DNA ile birleştirin ve hafifçe karıştırın.
20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Sonra, bu lipid reaktif DNA kompleksi 100 mikrolitre dağıtmak akıllıca damla, her kuyuda hücrelerin üstüne. Karıştırmak için tabağı hafifçe ileri geri sallayın.
Ve plakayı nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37 derecede 5 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, 100 nanogram CMV tahrikli EGFP ve DsRed ekspres DNA plazmidi ile transfect ek kuyular tazminat amaçlı. Başlamak için, büyüme ortamı ile uygun çalışma durumuna her gecikme geri ajan seyreltmek.
Çok kanallı bir boru kafası kullanarak, transfeksiyon ortamını dikkatlice aspire edin ve uygun gecikme geri alma maddesini içeren 100 mikrolitre orta ile değiştirin. 48 saat boyunca %5 karbondioksitle %37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Hücreleri boyamaya başlamak için, her kuyuya 100 mikrolitre PBS eklemek için çok kanallı bir boru kafası kullanın.
Yavaşça boru baş yukarı ve aşağı yaklaşık beş kez. Hücreleri medyaya ayırmak için köpürmekten kaçınmayı unutmayın. Daha sonra, hücreleri 96 kuyulu v-alt plakanın kuyularına aktarın.
500 kat yer çekiminde santrifüj ve beş dakika boyunca dört derece. Hücrelere dokunmadan orta ve PBS aspire. Hücreleri en az bir kez 200 mikrolitre protein ve serumsuz PBS ile yıkayın.
500 kat yer çekiminde santrifüj ve beş dakika boyunca dört derece. Supernatant'ı atmak için plakayı yatırın ve hücrelere dokunmadan yıkama tamponunu çıkarın. Bu seyreltme sonra protein ve serum serbest PBS sabit canlılık boya 1 ile 1000 oranında, bir çalışma çözümü hazırlamak için.
Her kuyuya seyreltilmiş boya50 mikrolitre ekleyin ve boru baş yukarı ve aşağı karıştırmak için. Dört santigrat derecede kuluçkaya yat. 10-15 dakika folyo kullanarak ışıktan korunurken.
Daha sonra hücreleri 150 mikrolitre yıkama tamponu ile bir veya iki kez yıkayın. Bundan sonra, 500 kat yerçekiminde santrifüj ve beş dakika boyunca dört santigrat derece, ve supernatant atın. Hücreleri düzeltmek için, taze hazırlanmış 100 mikrolitre ekleyin 1% formaldehit ve yıkama tampon.
Ve 10 ila 15 dakika ışıktan korunurken dört derecede kuluçkaya yat. Bundan sonra, 100 mikrolitre yıkama tamponu ile hücreleri bir veya iki kez yıkayın. 500 kat yer çekiminde santrifüj ve beş dakika boyunca dört derece.
Supernatant atın ve yıkama tampon 70 mikrolitre hücre pelet resuspend. Kalibrasyon boncukları çalıştırarak sitometre ayarlarının performansını ve hassasiyetini kontrol ettikten sonra, ön ve yan dağılım gerilimlerini lekesiz numuneyle ayarlayın, böylece ana popülasyon ekranda ve açıkça fark edilebilir olacak şekilde. Tek lekeli numuneleri kullanarak manuel veya otomatik telafi gerçekleştirin, EGFP pozitif popülasyonunun DsRed dedektörüne en az dökülmesini sağlayarak ve tam tersi.
Floresan eksi bir kontrolleri kullanarak, arsalar oluşturmak ve kapıları ayarlayın. Daha sonra, ön ve yan dağılım gerilimlerini lekesiz örnekle ayarlayın, böylece ana popülasyon ekranda ve açıkça fark edilebilir olacak şekilde. Örnek başına en az 10.000 canlı hücre olayı edinin ve kaydedin.
Bundan sonra, metin protokolünde özetlenen verileri analiz etmek için akış sitometrisi veri analizi yazılımını kullanın. Bromodomain inhibitörü JQ1 ile tedavi edildikten sonra HIV-1, parçacıksız ve birleştirilmiş ürünlerin ekspresyonu için temsil edilen sonuçlar, hem JQ1 pozitif hem de Tat'ın EGFP'yi ifade eden hücrelerin yüzdesini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bu da parçacıksız transkriptlerin göstergesi.
JQ1 pozitif de önemli ölçüde DsRed ifade hücrelerinin yüzdesini artırmak için görülmektedir. Ve spliced ürünün oranını Tat gibi benzer seviyelere artırmak. Bu JQ1 hiv transkripsiyon ve birleştirme açmak için pozitif yeteneğini doğrular.
Ancak, bir stereoizomer kontrolü JQ1 negatif ile tedavi, HIV transkripsiyon ve yapıştırma JQ1 olumlu etkisini ortadan kaldırır. Bir kez hakim, bu yöntem tek tek veya birlikte ilaçlar kullanılarak yapılabilir. Verimli bir şekilde sinerji kabiliyetlerini test ediyorlar.
Bu da ilacın daha düşük dozda ve toksisiteye yol açar. Her gelişmeden sonra, bu teknik ex vivo hasta örneklerinde gecikme birincil modellerde verimli ilaç kombinasyonları test etmek için yol açtı.
