O objetivo geral deste procedimento é avaliar in vitro, o impacto da latência revertendo agentes no processamento de HIV mRNA. O protocolo fornece um método simples e confiável para avaliar, simultaneamente, o efeito do IRA na transcrição e splicing do HIV. Esta técnica forneceu uma visão sobre a capacidade das LRAs de induzir a reativação e desobstrução do vírus do reservatório latente.
Após o cultivo de células, coloque 20.000 delas em 100 microliters de meio DMEM, complementadas com 10% de FBS, e sem antibióticos nos poços de uma placa inferior plana de 96 poços por 24 horas. No dia seguinte diluir a construção de repórter de dupla cor. Tat e Rev DNA em 50 microliters de meio livre de soro, e misture suavemente.
Misture suavemente o reagente lipídeto e, em seguida, dilua 0,65 microliters por reação em 50 microliters de meio livre de soro. Misture suavemente e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Misture o reagente lipídeto diluído com o DNA diluído e misture suavemente.
Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Então, dispense 100 microliters deste complexo de DNA de reagente lipídicos, em cima das células em cada poço. Balance o prato suavemente para frente e para trás para misturar.
E incubar a placa em uma incubadora umidificada, a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois disso, transfectar poços adicionais com 100 nanogramas de EGFP e DsRed expressos de DNA guiados por CMV e plasmídeo de DNA expresso DsRed para fins de compensação. Para começar, diluir cada agente reversível de latência para a condição de trabalho adequada com meio de crescimento.
Utilizando uma cabeça de tubulação multicanal, aspire cuidadosamente o meio de transfecção e substitua-o por 100 microliters de meio contendo o agente de reversão de latência apropriado. Incubar em uma incubadora umidificada a 37%celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Para começar a colorir as células, use uma cabeça de tubo multicanal para adicionar 100 microliters de PBS a cada poço.
Cabeça de tubo suavemente para cima e para baixo aproximadamente cinco vezes. Ao mesmo tempo em que evita evitar espuma para desprender as células na mídia. Em seguida, transfira as células para os poços de uma placa de fundo V de 96 poços.
Centrífuga a 500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por cinco minutos. Aspire o médio e o PBS sem tocar nas células. Lave as células pelo menos uma vez com 200 microliters de proteína e PBS sem soro.
Centrífuga a 500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por cinco minutos. Incline a placa para descartar o supernatante e remova o tampão de lavagem sem tocar nas células. Após isso diluir o corante de viabilidade fixa em proteína e PBS livre de soro a uma proporção de 1 a 1000, para preparar uma solução de trabalho.
Adicione 50 microliters do corante diluído a cada poço, e cabeça de tubo para cima e para baixo para misturar. Incubar a 4 graus celsius. Enquanto protegido contra a luz usando papel alumínio por 10 a 15 minutos.
Em seguida, lave as células uma ou duas vezes com 150 microliters de tampão de lavagem. Depois disso, centrífuga a 500 vezes a gravidade, e quatro graus celsius por cinco minutos, e descartar o supernante. Para corrigir as células, adicione 100 microliters de 1%formaldeído recém-preparado e tampão de lavagem.
E incubar a quatro graus celsius enquanto está protegido da luz por 10 a 15 minutos. Depois disso, lave as células uma ou duas vezes com 100 microliters de tampão de lavagem. Centrífuga a 500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por cinco minutos.
Descarte o supernatante e resuspenque a pelota da célula em 70 microliters de tampão de lavagem. Depois de verificar o desempenho e sensibilidade das configurações do cítômetro executando as contas de calibração, ajuste as tensões de dispersão dianteira e lateral com amostra não manchada, de modo que a população principal esteja na tela e claramente perceptível. Realize compensação manual ou automática usando as amostras manchadas únicas, garantindo o mínimo derramamento sobre a população positiva EGFP no detector DsRed e vice-versa.
Usando a fluorescência menos um controles, crie parcelas e afina os portões. Em seguida, ajuste as tensões de dispersão dianteira e lateral com amostra não manchada, de modo que a população principal esteja na tela e claramente discernível. Adquira e grave um mínimo de 10.000 eventos celulares viáveis por amostra.
Depois disso, use o software de análise de dados de citometria de fluxo para analisar os dados conforme descrito no protocolo de texto. Resultados representativos para a expressão do HIV-1, produtos não aplicados e emendados, após o tratamento com o inibidor de bromodomína JQ1, mostram que tanto o JQ1 positivo quanto o Tat, aumentam significativamente o percentual de células expressando EGFP. O que é indicativo de transcrições não pálicas.
O JQ1 positivo também é visto para aumentar significativamente a porcentagem de células expressando DsRed. E aumentar a proporção de produto emendado para níveis semelhantes aos de Tat. Isso confirma a capacidade do JQ1 positivo de ativar a transcrição e o splicing do HIV.
No entanto, o tratamento com um controle estereosomer JQ1 negativo, aboli o efeito positivo do JQ1 na transcrição e emenda do HIV. Uma vez dominado, este método pode ser realizado usando drogas individualmente ou em combinação. Testando sua capacidade de sinergizar eficientemente.
O que levaria a uma dose menor da droga e toxicidade. Após cada desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para testar combinações eficientes de medicamentos em modelos primários de latência em amostras de pacientes ex vivo.
