L’objectif global de cette procédure est d’évaluer in vitro, l’impact des agents inversion de latence sur le traitement de l’ARNm vih. Le protocole fournit une méthode simple et efficace pour évaluer, simultanément, l’effet de la LRA sur la transcription et l’épissage du VIH. Cette technique a permis de mieux comprendre la capacité des AL d’induire la réactivation et le dégagement du réservoir latent.
Après avoir cultivé des cellules, placez 20 000 d’entre elles dans 100 microlitres de DMEM moyen, complétées par 10% FBS, et sans antibiotiques dans les puits d’une plaque inférieure plate de 96 puits pendant 24 heures. Le lendemain diluer la construction journaliste double couleur. Adn de Tat et Rev dans 50 microlitres de milieu sans sérum, et mélanger délicatement.
Mélanger délicatement le réaccente lipidique, puis diluer 0,65 microlitres de celui-ci par réaction dans 50 microlitres de sérum moyen libre. Mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Mélanger le réaccente lipidique diluée avec l’ADN dilué et mélanger délicatement.
Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, distribuez 100 microlitres de ce complexe d’ADN de réagent lipidique goutte sage, sur le dessus des cellules dans chaque puits. Faire basculer délicatement l’assiette d’avant en arrière pour mélanger.
Et incuber la plaque dans un incubateur humidifié, à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Après cela, transfect puits supplémentaires avec 100 nanogrammes de CMV conduit EGFP et DsRed plasmide d’ADN express à des fins de compensation. Pour commencer, diluer chaque agent inversant de latence à l’état de fonctionnement approprié avec le milieu de croissance.
À l’aide d’une tête de tuyau multicanal, aspirez soigneusement le milieu de transfection et remplacez-le par 100 microlitres de milieu contenant l’agent inverseur de latence approprié. Incuber dans un incubateur humidifié à 37%celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Pour commencer à tacher les cellules, utilisez une tête de tuyau multicanal pour ajouter 100 microlitres de PBS à chaque puits.
Dirigez doucement la tête vers le haut et vers le bas environ cinq fois. Tout en s’assurant d’éviter la mousse pour détacher les cellules dans les médias. Ensuite, transférez les cellules dans les puits d’une plaque v-fond de 96 puits.
Centrifugeuse à 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le milieu et le PBS sans toucher les cellules. Lavez les cellules au moins une fois avec 200 microlitres de protéines et de sérum sans PBS.
Centrifugeuse à 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Inclinez la plaque pour jeter le surnatant et retirez le tampon de lavage sans toucher les cellules. Après cela diluer le colorant de viabilité fixe dans la protéine et le sérum sans PBS à un rapport de 1 à 1000, pour préparer une solution de travail.
Ajouter 50 microlitres de colorant dilué à chaque puits, et la tête de tuyau de haut en bas pour mélanger. Incuber à quatre degrés Celsius. Bien qu’il soit protégé de la lumière à l’aide de papier d’aluminium pendant 10 à 15 minutes.
Lavez ensuite les cellules une ou deux fois avec 150 microlitres de tampon de lavage. Après cela, centrifugeuse à 500 fois la gravité, et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Pour fixer les cellules, ajouter 100 microlitres de formaldéhyde fraîchement préparé 1% et laver tampon.
Et incuber à quatre degrés Celsius tout en étant protégé de la lumière pendant 10 à 15 minutes. Après cela, laver les cellules une ou deux fois avec 100 microlitres de tampon de lavage. Centrifugeuse à 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 70 microlitres de tampon de lavage. Après avoir vérifié les performances et la sensibilité des réglages du cytomètre en exécutant des perles d’étalonnage, ajustez les tensions de dispersion avant et latérale avec un échantillon non taché, de sorte que la population principale soit à l’écran et clairement discernable. Effectuez une compensation manuelle ou automatique en utilisant les échantillons tachés simples, assurant un déversement minimal de la population positive EGFP dans le détecteur DsRed et vice versa.
En utilisant la fluorescence moins un contrôle, créer des parcelles et définir les portes. Ensuite, ajustez les tensions de dispersion avant et latérale avec un échantillon non taché, de sorte que la population principale est à l’écran et clairement discernable. Acquérir et enregistrer un minimum de 10 000 événements cellulaires viables par échantillon.
Après cela, utilisez le logiciel d’analyse des données de cytométrie de flux pour analyser les données telles qu’elles sont décrites dans le protocole texte. Les résultats représentatifs pour l’expression des produits séropositifs, non épissés et épissés, après traitement avec l’inhibiteur du bromodomain JQ1, montrent que le JQ1 positif et le Tat augmentent considérablement le pourcentage de cellules exprimant l’EGFP. Ce qui est révélateur de transcriptions non compliquées.
JQ1 positif est également vu pour augmenter considérablement le pourcentage de cellules exprimant DsRed. Et augmenter la proportion de produits épissés à des niveaux similaires à Tat. Cela confirme la capacité de JQ1 positif à activer la transcription et l’épissage du VIH.
Cependant, le traitement par un contrôle stéréoisomer JQ1 négatif, abolit l’effet positif JQ1 sur la transcription et l’épissage du VIH. Une fois maîtrisée, cette méthode peut être effectuée en utilisant des médicaments individuellement ou en combinaison. Test pour leur capacité à synergiser efficacement.
Ce qui conduirait à une dose plus faible du médicament et la toxicité. Après chaque développement, cette technique a ouvert la voie à l’essai des combinaisons efficaces de drogue dans les modèles primaires de latence dans les échantillons de patient ex vivo.
