この手順の全体的な目標は、in vitro、HIV mRNA処理に対する遅延逆転剤の影響を評価することです。このプロトコルは、HIV転写およびスプライシングに対するLRAの効果を同時に評価するための、簡単で効率的で信頼性の高い方法を提供します。この技術は、潜伏貯留層のウイルス再活性化およびクリアランスを誘導するLRAの能力に関する洞察を提供した。
細胞を培養した後、そのうちの20,000をDMEM培地の100マイクロリットルに入れ、10%FBSを補充し、96ウェルの平らな底板の井戸に抗生物質を24時間入れます。翌日、デュアルカラーレポーターの構成を希釈します。50マイクロリットルの無血清培地でタットDNAとレヴDNAを、穏やかに混ぜます。
脂質試薬を軽く混ぜ、その後、血清遊離培地の50マイクロリットルで反応ごとに0.65マイクロリットルを希釈します。やさしく混ぜ、室温で5分間インキュベートします。希釈した脂質試薬と希釈したDNAを組み合わせ、軽く混ぜます。
室温で20分間インキュベートします。次いで、この脂質試薬DNA複合体の100マイクロリットルを、各ウェルの細胞の上に、微小に滴下する。プレートを軽く前後に揺らし、混ぜます。
加湿インキュベーターでプレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度で5時間インキュベートします。この後、CMV駆動EGFPおよびDsRedの100ナノグラムで追加のウェルをトランスフェクトし、補償目的でDNAプラスミドを発現させる。開始するには、各遅延反転剤を、成長培地を使用して適切な作業条件に希釈します。
マルチチャネルパイプヘッドを用いて、トランスフェクション媒体を慎重に吸引し、適当なレイテンシ反転剤を含む培地100マイクロリットルに交換する。加湿インキュベーターで37%摂氏で5%の二酸化炭素を48時間インキュベートします。細胞の染色を開始するには、マルチチャネルパイプヘッドを使用して、各ウェルに100マイクロリットルのPBSを追加します。
頭を上下に約5回軽くパイプします。メディアに細胞を取り外すために泡立つのを避けるようにしながら。次に、細胞を96ウェルVボトムプレートのウェルに移します。
500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で5分間。培地とPBSを細胞に触れずに吸引する。タンパク質と血清を含まないPBSの200マイクロリットルで、細胞を少なくとも1回洗浄してください。
500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で5分間。プレートを傾けて上清を捨て、細胞に触れることなく洗浄バッファーを取り除きます。この後、タンパク質および血清遊離PBS中の固定生生存性染料を1〜1000の割合で希釈した後、働く溶液を調製した。
希釈した染料50マイクロリットルを各ウェルに加え、ヘッドを上下にパイプで混ぜます。摂氏4度でインキュベートする。10〜15分間ホイルを使用して光から保護しながら。
その後、150マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を1〜2回洗浄します。その後、500倍の重力で遠心分離し、5分間摂氏4度で上清を捨てます。細胞を固定するには、100マイクロリットルの作りたての1%ホルムアルデヒドと洗浄バッファーを加えます。
そして、10〜15分間光から保護しながら、摂氏4度でインキュベートします。この後、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を1〜2回洗浄します。500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で5分間。
上清を捨て、細胞ペレットを70マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁する。キャリブレーションビーズを実行してサイトメーターの設定性能と感度を確認した後、主母集団が画面上にあり、はっきりと識別できるように、染色されていないサンプルで前方および側の散乱電圧を調整します。単一の染色されたサンプルを使用して手動または自動補償を行い、EGFP陽性母集団のDsRed検出器への流出を最小限に抑え、その逆も可能です。
蛍光から1つのコントロールを引いたものを使用して、プロットを作成し、ゲートを設定します。次に、主母集団が画面上にあり、はっきりと識別できるように、順方向および側面の散乱電圧を染色されていないサンプルで調整します。サンプルごとに最低 10,000 個の実行可能なセル イベントを取得して記録します。
その後、フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを用いて、テキストプロトコルに概説されているようにデータを解析する。HIV-1の発現に関する代表的な結果は、非スプライシングおよびスプライシングされた製品が、ブロモドメイン阻害剤JQ1で処理した後、JQ1陽性およびTatの両方が、EGFPを発現する細胞の割合を有意に増加することを示す。これは、非スプライシングされたトランスクリプトを示しています。
JQ1陽性もまた、DsRedを発現する細胞の割合を有意に増加させることが分かる。そして、Tatと同様のレベルにスプライスされた製品の割合を増やします。これは、Hivの転写およびスプライシングをオンにするJQ1陽性の能力を確認する。
しかしながら、立体異性体対照JQ1陰性での治療は、HIV転写およびスプライシングに対するJQ1陽性作用を廃止する。一度マスターすると、この方法は、個別に、または組み合わせて薬物を使用して行うことができる。効率的に相乗効果を発揮する能力をテストする。
これは、薬物と毒性の低用量につながるだろう.各開発の後、この技術は、ex vivo患者サンプルにおける待ち時間の一次モデルにおける効率的な薬剤の組み合わせをテストする道を開いた。
