이 절차의 전반적인 목표는 시험관 내, HIV mRNA 처리에 대기 시간 반전 에이전트의 충격을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 LRA가 HIV 전사 및 접합에 미치는 영향을 동시에 평가하기 위한 간단효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 LA가 잠복 저장소의 바이러스 재활성화 및 허가를 유도하는 능력에 대한 통찰력을 제공했습니다.
세포를 재배한 후, DMEM 배지 100마이크로리터에 20, 000을 배치하고, 10%의 FBS로 보충하고, 96웰의 평평한 바닥 판의 우물에 항생제없이 24시간 동안 배치한다. 다음날 이중색 기자 구도가 희석됩니다. Tat와 Rev DNA는 무혈제 배지 50 마이크로리터로 부드럽게 섞습니다.
지질 시약을 부드럽게 혼합한 다음 반응당 0.65 마이크로리터를 혈청 프리 배지 50마이크로리터에 희석시 희석시. 부드럽게 섞고 실온에서 5분간 배양합니다. 희석된 지질 시약을 희석된 DNA와 결합하고 부드럽게 섞습니다.
실온에서 20분 동안 배양하세요. 그런 다음, 이 지질 시약 DNA 복합체의 100 마이크로리터를 각 우물의 세포 위에 현명하게 떨어뜨리는 것을 분배합니다. 접시를 부드럽게 앞뒤로 흔들어 섞습니다.
그리고 가습 된 인큐베이터에서 접시를 5 시간 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그 후, CMV 구동 EGFP의 100 나노그램을 가진 추가 우물과 DsRed는 보상 목적을 위해 DNA 플라스미드를 표현합니다. 시작하려면 각 대기 시간 반전 에이전트를 성장 매체를 사용하여 적절한 작업 상태로 희석합니다.
다중 채널 파이프 헤드를 사용하여, 조심스럽게 트랜스퍼션 매체를 흡인하고, 적절한 대기 시간 반전제를 포함하는 매체의 100 마이크로리터로 교체한다. 가습 된 인큐베이터에서 37 %의 섭씨37 %의 이산화탄소를 48 시간 동안 배양하십시오. 세포를 염색하기 시작하려면 다중 채널 파이프 헤드를 사용하여 각 웰에 100 마이크로리터의 PBS를 추가합니다.
머리를 약 5회 위아래로 부드럽게 파이프합니다. 세포가 미디어로 분리되는 거품을 피해야 합니다. 다음으로, 세포를 96웰 V-하단 플레이트의 우물로 옮킨다.
원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 세포를 건드리지 않고 배지와 PBS를 흡인합니다. 단백질과 세럼 무료 PBS의 200 마이크로 리터와 함께 적어도 한 번 세포를 씻어.
원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 접시를 기울여 상체를 버리고 셀을 건드리지 않고 세척 버퍼를 제거합니다. 이 후에 단백질 및 혈청 무료 PBS에서 고정 생존성 염료를 1 대 1000의 비율로 희석시키고, 작업 용액을 준비한다.
각 우물에 희석 된 염료50 마이크로 리터를 추가하고 파이프 헤드를 위아래로 섞습니다. 섭씨 4도에서 배양하십시오. 10~15분 동안 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
그런 다음 세척 버퍼 150 마이크로 리터로 세포를 한두 번 씻으면 씻습니다. 그 후, 원심분리기는 중력500배, 섭씨 4도에서 5분간, 상수부를 폐기한다. 세포를 고치려면 새로 준비된 1% 포름알데히드의 마이크로리터 100마이크로리터를 추가하고 버퍼를 세척합니다.
그리고 10~15분 동안 빛으로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 배양합니다. 그 후, 세척 버퍼 의 100 마이크로 리터와 함께 한 두 번 세포를 씻어. 원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 5분간.
상체를 버리고, 세척 버퍼의 70 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 교정 구슬을 실행하여 사이토미터 설정 성능과 감도를 확인한 후, 스테인드 샘플로 전방 및 측면 산란 전압을 조정하여 주 인구가 화면에 있고 명확하게 식별할 수 있도록 합니다. 단일 스테인드 샘플을 사용하여 수동 또는 자동 보정을 수행하여 EGFP 양성 집단을 DsRed 검출기로 최소한의 유출을 보장하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
형광을 사용하여 하나의 컨트롤을 뺀 다음 플롯을 만들고 게이트를 설정합니다. 다음으로, 주 인구가 화면에 있고 명확하게 식별할 수 있도록 스테인드 샘플로 전방 및 측면 분산 전압을 조정합니다. 샘플당 최소 10, 000개의 실행 가능한 셀 이벤트를 획득하고 기록합니다.
그런 다음 흐름 세포 측정 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. HIV-1, 결합되지 않은 및 접합 제품의 발현을 위한 대표적인 결과는 브로모도메인 억제제 JQ1로 치료한 후 JQ1 양성 및 Tat 모두 EGFP를 발현하는 세포의 비율을 크게 증가시키는 것을 보여줍니다. 이는 접합되지 않은 성적 증명서를 나타냅니다.
JQ1 양성도 DsRed를 표현하는 세포의 비율을 크게 증가시키는 것으로 보입니다. 그리고 Tat와 유사한 수준으로 접합 제품의 비율을 증가. 이것은 JQ1 의 능력을 확인 HIV 전사및 접합에 설정하는 긍정적 인.
그러나, 스테레오소머 제어 JQ1 음성치료, HIV 전사 및 접합에 대한 JQ1 양성 효과를 폐지한다. 일단 마스터되면, 이 방법은 개별적으로 또는 조합하여 약물을 사용하여 수행 될 수있다. 효율적으로 시너지 효과를 낼 수 있는 능력에 대한 테스트.
이는 약물과 독성의 낮은 복용량으로 이어질 것입니다. 각 개발 후, 이 기술은 전 생체 내 환자 샘플에서 대기 시간의 기본 모델에서 효율적인 약물 조합을 테스트하기위한 길을 열었습니다.
