يقوم بروتوكولنا بتقييم آثار الخلايا القامع المشتقة من النخاعي والضامة المرتبطة بالورم في الخلايا السرطانية التي تسببها الخلايا التائية. جنبا إلى جنب مع التحقيق في الآليات الأساسية للتدخلات العلاجية المحتملة. هذا البروتوكول يقيم مباشرة الخلايا الورم المبرمج الخلايا السرطانية التي تسببها الخلايا مع حساسية عالية، وتمكن من التحليل الطولي وتصوير التفاعلات من خلية إلى خلية.
أفضل نظر فعالية مثبطات نقطة التفتيش من خلال الخلايا النخاعية التي تتسلل إلى الورم في أنواع معينة من الأورام. هذه التقنية يمكن أن تؤدي إلى تحديد العلاجات الجديدة لهذه الأورام. هذه الطريقة لا يمكن أن تقدم فقط أبحاث مناعة السرطان، ولكن يمكن أيضا أن توفر نظرة ثاقبة في نقص المناعة وأمراض المناعة الذاتية.
لتفعيل وتوسيع خلايا CD8-إيجابية CD8-إيجابية الطحال، أول aliquot مرة واحدة مرات 10 إلى الخامس CD8 إيجابية الخلايا التائية في 50 ميكرولترات من E-DMEM في آبار فردية من 96 بئر U-القاع لوحة. بعد ذلك، إضافة مرة واحدة 10 إلى الخلايا القامع الخامس في 50 ميكرولترات من E-DMEM، أو 50 ميكرولترات من E-DMEM وحدها، في كل بئر من الخلايا التائية. ثم إضافة 50 ميكرولترات من المتوسط التنشيط الطازجة وإعداد 50 ميكرولترات من E-DMEM، مع أو بدون الكواشف اختبار الفائدة، إلى الآبار المناسبة.
ووضع لوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ مع رطوبة 95٪لمدة أربعة أيام. لإعداد خلية مستهدفة مدمجة مدمجة مدمجة مدمجة مسبقًا ، أضف أولاً 30 ميكرولترات من 1 إلى 100 مخففة من عوامل النمو القابلة للذوبان في الطابق السفلي إلى الآبار المناسبة لصفيحة مسطحة القاع 96 بئرًا ، مناسبة للمجهر. يهز لوحة لنشر المصفوفة بالتساوي، ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
بينما اللوحة هي توازن، وإعداد الخلايا المستهدفة. استلهم الوسط، واغسله مع برنامج تلفزيوني، وأضيف ملليلتر واحد من 05٪ لتربسين-EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إضافة تسعة ملليلتر من DMEM تكملها مصل البقرة الجنينية عن طريق الأنابيب لطيف، ونقل الخلايا المتفككة في أنابيب.
بعد الطرد المركزي للخلايا، إعادة تعليق البليت في 500 ميكرولترات من E-DMEM. تصفية الخلايا التي تم إعادة فرضها من خلال مصفاة الخلايا، ثم عد الخلايا الحية. ثم ضبط كثافة إلى أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الهدف الرابع لكل ملليلتر في طازج E-DMEM على الجليد.
بعد ذلك ، الماصات الخلايا T-POSITIVE CD8-positive مسبقًا عدة مرات لإعادة تعليق الخلايا في تعليق خلية واحدة، ونقل الخلايا التائية العائمة إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر لكل حالة. جمع أي الخلايا المتبقية مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر، ونقل يغسل في أنابيب 1.5 ملليلتر المناسبة، والطرد المركزي. استلهم الوسط وأضف ملليلترًا واحدًا من E-DMEM إلى كل أنبوب للطرد المركزي.
بعد الطرد المركزي، resuspend الكريات في 100 ميكرولترات من الطازجة E-DMEM لكل أنبوب. بعد العد، وضبط الخلايا في كل أنبوب إلى كثافة 1.6 مرات 10 إلى الخامس قبل تنشيط CD8 إيجابية الخلايا التائية لكل ملليلتر من المتوسطة، ووضع الخلايا على الجليد. عندما تكون الخلايا جاهزة ، تتبخر مصفوفة الغشاء السفلي من كل بئر من لوحة المجهر 96 بئرًا ، وإضافة 50 ميكرولترات من الخلايا المستهدفة إلى الآبار الفردية داخل 60 بئرًا داخلية من اللوحة مع الاختلاط.
إضافة 25 ميكرولتر من E-DMEM تستكمل مع أربعة أضعاف 10 إلى الوحدات الثالثة لكل ملليلتر من IL2، و 10- ميكرومولر فلورية الفلورا فلورية- 3 الركيزة إلى الآبار المناسبة. ثم إضافة 25 ميكرولترات من خلايا T-إيجابية CD8 مسبقًا إلى الآبار المناسبة. وأخيرا، إضافة E-DMEM إلى الآبار المناسبة لجعل حجم إجمالي يصل إلى 100 ميكرولتر.
إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني أو الماء العقيم في جميع الآبار الفارغة. يهز لوحة، وترك لوحة على سطح مستو لمدة 10 دقائق. لتصوير الخلايا، قم بتعيين المجهر للحصول على الصور في مرحلة التباين.
فضلا عن قنوات الفلوريسنس مناسبة للبروتين الفلورسنت المقيدة نوويا، والفلوروجينيك المنشط الفلوريوفلورور الركيزة 3 المستخدمة في التجربة. ثم التقاط صور لكل بئر تجريبية في المرحلة النقيض وقنوات الفلوريسنس كل واحد إلى ثلاث ساعات لمدة 72 ساعة على الأقل. لتحليل الصور الملتقطة، افتح صورة من عنصر تحكم يحتوي على خلايا مستهدفة فقط ومتوسطة دون الركيزة من caspase-3 في قناة الفلوريسكين المستخدمة في إشارة الركيزة.
لاحظ ما إذا كانت إشارة الفلورس غير الملائمة تنبعث من النوى. إذا كانت إشارة الركيزة واضحة داخل النوى، استخدم التكبيك الطيفي لزيادة النسبة المئوية للإشارة الركيزة التي تم إزالتها من إشارة النوى، حتى تختفي إشارة الركيزة. بعد ذلك، عرض جيدا السيطرة التي تحتوي على الخلايا غير موسومة فقط nuclei تأثير في المتوسط دون الركيزة caspase-3 في القنوات الفلورية اثنين بشكل فردي.
مراقبة ما إذا كان يتم إصدار إشارة من النوى. إذا لم تظهر إشارة في القنوات الفردية، لا يلزم فك التكبيك الطيفي. لحل الكائنات الفلورية في كل من قنوات الفلوريسين، استخدم أسلوب الطرح الخلفية الفلورية مع معلمات ذات صلة للعينة والمعلمات المناسبة لتقسيم الحافة.
استخدام صور من الخلية المستهدفة أحادية الزراعة لتحديد المعلمات لخلايا الفلورس النووية المستهدفة. استخدام صور من أحادية الخلية المفعول لوضع المعلمات للفلوروس النووي الناجم عن الركيزة. استخدام صور الثقافة المشتركة للتحقق من أو صقل المعلمات للفلوروس النووي المستحث بالركيزة الذرية في الخلايا المستهدفة.
لتحديد الحد الأدنى لحجم النوى المستهدفة، استخدم الصور في قناة إشارة النوى من الآبار التي تحتوي على الخلايا المستهدفة فقط مع الركيزة البرميلية. لتحديد متوسط حجم نوى الأثر المبرمج، استخدم الصور في قناة إشارة الركيزة من الآبار التي تحتوي على خلايا المفعول فقط مع الركيزة caspase. لحساب عدد من النوى الخلية المستهدفة fluorescence، إعداد إجراء تحليل باستخدام الحد الأدنى المناسب من حجم القيد.
باستخدام صور أحادية الثقافة الخلية، قم بإعداد إجراء تحليل ثاني لحساب عدد النوى المبرمجة التي هي أكبر من متوسط حجم نوى المفعول المبرمج. ثم قم بإعداد إجراء تحليل ثالث لحساب عدد الخلايا المستهدفة المبرمجة عن طريق عد عدد النوى التي تشارك فيها إشارة النواة وإشارة الركيزة المقيدة بالحجم بشكل كبير في التوطين. عادة، تزيد الخلايا السرطانية من إشارة الفلوريسنس في نواتها بعد تنشيط جهاز استشعار حيوي لكاسباس المستهدَف نووياً عندما تتصل الخلايا بالخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم تنشيطها مسبقًا بواسطة الأجسام المضادة في غياب الخلايا الخافعة.
أحجام نواة الخلايا التائية إيجابية CD8 أصغر من تلك الخلايا السرطانية. وهكذا، يمكن استبعاد الخلايا المُفعِّل المبرمج من عد الخلايا الهدف المبرمج بواسطة طريقة تحليل صور تقييد الحجم. على الرغم من أن بعض الخلايا السرطانية المستهدفة تظهر شكلًا دائريًا صغيرًا بدون الفلورالزية الركيزة ، إلا أن هذا لا يؤثر على التحليل.
كما تخضع هذه الخلايا الانقسام بدلا من المبرمج وبالتالي يتم استبعادها من تعداد الخلايا المستهدفة المبرمج بقناع تداخل إشارة الركيزة النووية. الثقافة المشتركة للخلايا السرطانية المستهدفة مع الخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم تنشيطها مسبقًا تزيد من موت الخلايا السرطانية فوق مستويات المبرمج التلقائي في الخلايا السرطانية أحادية الخلايا. عموما، عند استخدام النسبة المثلى من الخلايا السرطانية الهدف إلى الخلايا التي تحقق effector، يمكن ملاحظة ذروة في عدد الخلايا السرطانية الهدف المبرمج.
وتصبح هذه الذروة أكثر تميزاً عندما يتم التعبير عن البيانات باعتبارها الجزء المبرمج من مجموعة الخلايا المستهدفة. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا البروتوكول هو إعداد أحادية من الخلايا المستهدفة وزراعة أحادية من الخلايا المُفعِّل لاستخدامها في تطوير أقنعة التحليل. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على مدة وتواتر الخلايا التائية لتفاعلات الخلايا السرطانية ، والحالات المرتبطة بالسمية الخلوية المعتمدة على الجينات في كل من خلايا الإنسان والفأر.
نحن حاليا تطوير هذا الفحص في شاشة عالية الإنتاجية باستخدام الخلايا البشرية لتحديد المركبات التي تمنع من كبت المناعة بوساطة الخلية النخاعية وبالتالي تعزيز فعالية مثبطات نقطة التفتيش.
