Protokolümüz miyeloid kaynaklı baskılayıcı hücrelerin ve T hücrekaynaklı tümör hücreli apoptozdaki tümörilişkili makrofajların etkilerini değerlendirmez. Potansiyel terapötik müdahalelerin altında yatan mekanizmaların araştırılmasının yanı sıra. Bu protokol t-hücre kaynaklı tümör hücreli apoptozu yüksek duyarlılıkla doğrudan değerlendirir ve hücreden hücreye etkileşimlerin uzunlamasına analizini ve görüntülenmesini sağlar.
Kontrol noktası inhibitörü etkinliği en iyi bazı tümör tiplerinde tümör-infiltrasyon miyeloid hücreler tarafından bakılır. Bu teknik bu tümörler için yeni tedavilerin belirlenmesine yol açabilir. Bu yöntem sadece kanser immünoloji araştırma ilerlemek olamazdı, ama potansiyel olarak da immün yetmezlik ve otoimmün hastalıklar içine fikir sağlayabilir.
Dalak izole CD8-pozitif T-hücrelerinin aktivasyonu ve genişlemesi için, ilk olarak 10 kez beşinci CD8-pozitif T-hücrelerine 50 mikrolitre E-DMEM'de 96-iyi u-alt plakanın tek tek kuyularına yerleştirin. Daha sonra, 50 mikrolitre E-DMEM'deki beşinci baskılayıcı hücrelere 10 kez veya tek başına 50 mikrolitre E-DMEM'i T-hücrelerinin her kuyusuna ekleyin. Daha sonra 50 mikrolitre taze hazırlanmış aktivasyon ortamı ve 50 mikrolitre E-DMEM, test reaktifleri ile veya faizsiz, uygun kuyulara ekleyin.
Ve plakayı 4 gün boyunca %95 nem oranıyla 37 derecelik ve %5 karbondioksit kuvöze yerleştirin. Önceden aktive edilmiş CD8-pozitif T-hücre hedef hücre ortak kültürünü kurmak için, ilk olarak mikroskopi için uygun 96 kuyulu düz alt plakanın uygun kuyularına 1 ila 100 seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış çözünür baza membran matrisinin 30 mikrolitresini ekleyin. Matrisi eşit olarak yaymak için plakayı sallayın ve plakayı en az bir saat hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Plaka dengelenirken, hedef hücreleri hazırlayın. Orta aspire, PBS ile yıkayın ve bir dakika oda sıcaklığında% 05 Tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Hafif pipetleme ile fetal sığır serumu ile desteklenen dokuz mililitre DMEM ekleyin ve ayrık hücreleri tüplere aktarın.
Hücreleri santrifüj ettikten sonra 500 mikrolitre E-DMEM'deki paleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri bir hücre süzgecinden geçirin ve canlı hücreleri sayın. Daha sonra yoğunluğu dört kez 10'a, buz üzerindeki taze E-DMEM'de mililitre başına dördüncü hedef hücrelere ayarlayın.
Daha sonra, pipet önceden aktive CD8-pozitif T-hücreleri birkaç kez tek bir hücre süspansiyon içine hücreleri yeniden askıya almak ve durum başına bir 1.5 mililitrelik tüp içine yüzen T hücreleri aktarın. Kuyu başına 200 mikrolitre PBS ile kalan hücreleri toplamak, uygun 1.5 mililitre tüpler içine yıkıntı lar aktarın ve santrifüj. Orta aspire ve santrifüj için her tüp e-DMEM bir mililitre ekleyin.
Santrifüjden sonra, tüp başına 100 mikrolitre taze E-DMEM peletleri yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, her tüpteki hücreleri mililitre başına beşinci önceden aktive edilmiş CD8-pozitif T-hücrelerine 1,6 kat 10'luk bir yoğunluğa ayarlayın ve hücreleri buza yerleştirin. Hücreler hazır olduğunda, 96-iyi mikroskopplaka her kuyudan bodrum membran matris aspire ve karıştırma ile plaka iç 60 kuyu içinde bireysel kuyulara hedef hücrelerin in 50 mikrolitre ekleyin.
Il2 mililitre başına üçüncü ünitelere dört kez 10 ile takviye e-DMEM 25 mikrolitre ekleyin ve uygun kuyulara 10 mikromolar florojenik kaspaz-3 substrat ekleyin. Daha sonra uygun kuyulara önceden aktive edilmiş CD8 pozitif T-hücrelerinin 25 mikrolitreekleyin. Ve son olarak, 100 mikrolitreye kadar toplam hacim yapmak için uygun kuyulara E-DMEM ekleyin.
Tüm boş kuyulara 200 mikrolitre PBS veya steril su ekleyin. Plakayı sallayın ve plakayı düz bir yüzeyde 10 dakika bekletin. Hücreleri görüntülemek için, faz kontrastında görüntü elde etmek için mikroskobu ayarlayın.
Nükleer sınırlı floresan proteiniçin uygun floresan kanallarının yanı sıra deneyde kullanılan florojenik aktive kaspaz-3 substrat floroporesi de vardır. Daha sonra faz kontrastı ve iki floresan kanalı en az 72 saat boyunca her bir ila üç saat boyunca her deneysel kuyunun görüntülerini yakalayın. Yakalanan görüntüleri analiz etmek için, substrat sinyali için kullanılan floresan kanalında caspase-3 substratı olmayan sadece hedef hücreleri ve orta içeren bir kontrol kuyunundan bir görüntü açın.
Çekirdekler tarafından uygunsuz bir floresan sinyalinin yayılıp yayılmadığını gözlemleyin. Eğer substrat sinyali çekirdekler içinde görünürse, substrat sinyali kaybolana kadar çekirdek sinyalinden çıkarılan substrat sinyalinin yüzdesini artırmak için spektral unmixing kullanın. Daha sonra, iki floresan kanalında tek tek kaspaz-3 substratı olmayan orta ortamda yalnızca çekirdekleri etiketlenmemiş efektör hücreleri içeren bir kontrol kuyusu görüntüleyin.
Bir sinyalin çekirdekler tarafından yayılıp yayılmadığını gözlemleyin. Tek tek kanallarda sinyal yoksa, spektral karıştırma gerekmez. Floresan nesneleri her iki floresan kanaldaki çözmek için, numune için ilgili parametreleri ve kenar bölme için uygun parametreleri içeren bir floresan arka plan çıkarma yöntemi kullanın.
Hedef hücre nükleer floresan için parametreleroluşturmak için hedef hücre monokültür görüntüleri kullanın. Substrat kaynaklı apoptotik nükleer floresan için parametreler oluşturmak için efektör hücre monokültür görüntülerini kullanın. Hedef hücrelerde substrat kaynaklı apoptotik nükleer floresan parametreleri doğrulamak veya iyileştirmek için eş kültür görüntülerini kullanın.
Hedef çekirdeklerin minimum boyutunu belirlemek için, sadece caspase substratı olan hedef hücreleri içeren kuyulardan gelen çekirdek sinyal kanalındaki görüntüleri kullanın. Apoptotik efektör çekirdeklerin ortalama boyutunu belirlemek için, sadece caspase substratlı efektör hücreleri içeren kuyulardan substrat sinyal kanalındaki görüntüleri kullanın. Floresan hedef hücre çekirdeklerinin sayısını saymak için, uygun bir minimum boyut kısıtlaması kullanarak bir analiz prosedürü ayarlayın.
Efektör hücre monokültür görüntüleri kullanarak, apoptotik efektör çekirdeklerinin ortalama boyutundan daha büyük olan apoptotik çekirdeklerin sayısını saymak için ikinci bir analiz prosedürü ayarlayın. Daha sonra, çekirdek sinyalinin ve boyut kısıtlamalı substrat sinyalinin önemli ölçüde birlikte lokalize olduğu çekirdek sayısını sayarak apoptotik hedef hücrelerin sayısını saymak için üçüncü bir analiz prosedürü ayarlayın. Tipik olarak, kanser hücreleri nükleer hedefli bir kaspaz biyosensor aktivasyonu sonrasında kendi çekirdeklerinde floresan sinyali artırmak hücreler bastırıcı hücrelerin yokluğunda antikorlar tarafından önceden aktive CD8-pozitif T-hücreleri ile temas yapmak.
CD8-pozitif T-hücrelerinin çekirdek boyutları kanser hücrelerininkinden daha küçüktür. Böylece, apoptotik efektör hücreleri bir boyut kısıtlaması görüntü analizi yöntemi ile apoptotik hedef hücre sayımları hariç tutulabilir. Bazı hedef kanser hücreleri substrat floresan olmadan küçük bir yuvarlak şekil sergilemesine rağmen, bu analizi etkilemez.
Bu hücreler apoptoz yerine mitoz geçirilir ve böylece bir nükleer substrat sinyal örtüşme maskesi ile apoptotik hedef hücre sayımları hariç tutulur. Önceden aktive CD8-pozitif T-hücreleri ile hedef kanser hücrelerinin ortak kültür kanser hücresi monokültürlerinde spontan apoptoz düzeylerinin üzerinde tümör hücreli apoptosis artırır. Genellikle, etki civarı hücrelerine hedef kanser hücrelerinin optimal bir oranı kullanırken, apoptotik hedef kanser hücrelerinin sayısında bir tepe görülebilir.
Veriler hedef hücre popülasyonunun apoptotik fraksiyonu olarak ifade edildiğinde bu tepe daha belirgin hale gelir. Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, analiz maskelerinin geliştirilmesinde kullanılmak üzere hedef hücrelerin ve efektör hücrelerin monokültürlerinin tek kültürlerini kurmaktır. Bu yöntem, t-hücresinin kanser hücresi etkileşimlerine olan süresi ve sıklığı ve hem insan hem de fare hücrelerinde gen bağımlı sitotoksisite ile ilişkili koşullar hakkında bilgi sağlayabilir.
Şu anda miyeloid hücre aracılı immünsupresyon inhibe ve böylece kontrol noktası inhibitörü etkinliğini artırmak bileşikleri tanımlamak için insan hücreleri kullanarak yüksek verimli bir ekran içine bu testi geliştiriyoruz.
