הפרוטוקול שלנו מעריך את ההשפעות של תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים ואת המקרופאגים הקשורים לגידול באפופטוזיס של תאי גידול הנגרמים על ידי תאי T. לצד חקירת המנגנונים הבסיסיים של התערבויות טיפוליות אפשריות. פרוטוקול זה מעריך ישירות אפופטוזיס של תאי גידול הנגרמים על-ידי תאי T ברגישות גבוהה ומאפשר ניתוח אורך והדמיה של אינטראקציות בין תאים לתאים.
היעילות של מעכבי מחסום הוא הסתכל בצורה הטובה ביותר על ידי תאים מיאלואידים חדירה לגידולים בסוגי גידול מסוימים. טכניקה זו יכולה להוביל לזיהוי של טיפולים חדשניים עבור גידולים אלה. שיטה זו יכולה לא רק לקדם מחקר אימונולוגיה של סרטן, אבל יכול גם לספק תובנה לתוך כשל חיסוני ומחלות אוטואימוניות.
עבור ההפעלה וההרחבה של תאי T חיוביים CD8 מבודד טחול, aliquot הראשון פעם אחת 10 כדי CD8 חיובי החמישי T-תאים ב 50 microliters של E-DMEM לתוך בארות בודדות של לוח 96-well U-bottom. לאחר מכן, הוסף פעם אחת 10 לתאי המדכא החמישי ב-50 מיקרוליטרים של E-DMEM, או 50 מיקרוליטרים של E-DMEM בלבד, לכל באר של תאי T. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום הפעלה טרי ו-50 מיקרוליטרים של E-DMEM, עם או בלי המבחן, ל הבארות המתאימות.
ומ מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם 95% לחות במשך ארבעה ימים. כדי להגדיר תא יעד T-cell T חיובי המופעל מראש, הוסף תחילה 30 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף מסיסת מופחתת גורם גדילה 1 עד 100 ל- 100 ל הבאר המתאימה של צלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות, המתאימה למיקרוסקופיה. מנערים את הצלחת כדי להפיץ את המטריצה באופן שווה, ומ מניחים את הצלחת ב החממה לתרבות התאים למשך שעה אחת לפחות.
בזמן שהצלחת נמצאת בהוויה, הכינו את תאי המטרה. שאפו את המדיום, שטפו עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של 05% טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הוסף תשעה מיליליטר של DMEM בתוספת סרום חזיר עוברי על ידי צינורות עדינים, ולהעביר את התאים דיסוציאציה לתוך צינורות.
לאחר צנטריפוגה של התאים, תן שימוש חוזר במשטחים ב-500 מיקרוליטרים של E-DMEM. סנן את התאים המתווסתים באמצעות מסננת תאים וספירת התאים החיים. לאחר מכן התאימו את הצפיפות לפי 4 מ-10 לתאי המטרה הרביעיים למיליליטר ב-E-DMEM טרי על קרח.
לאחר מכן, פיפטה תאי T חיוביים CD8 מופעל מראש כמה פעמים כדי להשתמש מחדש את התאים לתוך מתלה תא יחיד, ולהעביר את תאי T צף לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר לכל תנאי. לאסוף את כל התאים הנותרים עם 200 microliters של PBS לגם, להעביר את השטיפה לתוך הצינורות המתאימים 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה. שאפו את המדיום והוסיפו מיליליטר אחד של E-DMEM לכל צינור לצנטריפוגה.
לאחר הצנטריפוגה, יש למנוסה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטרים של E-DMEM טרי לצינור. לאחר הספירה, התאים בתאים בכל צינור לצפיפות של פי 1.6 10 לתאי ה- T החיוביים של CD8 המופעלים מראש למיליליטר של מדיום, ומ מניחים את התאים על קרח. כאשר התאים מוכנים, שאפו את מטריצת קרום המרתף מכל באר של צלחת המיקרוסקופיה בת 96 הבאר, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של תאי מטרה לבירות בודדות בתוך 60 הבאר הפנימית של הצלחת עם ערבוב.
הוסף 25 מיקרוליטרים של E-DMEM בתוספת ארבע פעמים 10 ליחידות השלישיות למיליליטר של IL2, ו 10 מיקרומולרים פלואורוגניים caspase-3 מצע ל בארות המתאימות. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תאי T חיוביים ל-CD8 שהופעלו מראש ל בארות המתאימות. ולבסוף, להוסיף E-DMEM ל בארות המתאימות כדי להפוך את נפח כולל של עד 100 microliters.
הוסיפו 200 מיקרוליטרים של PBS או מים סטריליים לכל בארות הריקות. לנער את הצלחת, ולהשאיר את הצלחת על משטח שטוח במשך 10 דקות. כדי לדמיין את התאים, הגדר את המיקרוסקופ לרכישת תמונות בניגודיות פאזה.
כמו גם תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לחלבון הפלואורסצנטי המוגבל לגרעין, ולפליאואורופורים פלואורוגניים המופעלים על ידי מצעים-3 המשמשים בניסוי. ואז ללכוד תמונות של כל באר ניסיונית בניגוד פאזה ואת שני ערוצי פלואורסצנטיות כל שעה עד שלוש שעות לפחות 72 שעות. כדי לנתח את התמונות שנלכדו, פתח תמונה מ באר בקרה המכילה רק תאי יעד ובינוניים ללא מצע CASPASE-3 בערוץ הפלואורסצנטי המשמש לאות מצע.
שימו לב אם אות פלואורסצנטי לא הולם נפלט על ידי הגרעינים. אם אות המצע ניכר בתוך הגרעינים, השתמש בספקטרלי unmixing כדי להגדיל את אחוז אות המצע הוסר מאות הגרעינים, עד אות המצע נעלם. לאחר מכן, הצג באר בקרה המכילה רק תאי אפקט גרעינים ללא חגורה במדיום ללא מצע Caspase-3 בשני ערוצי הפלואורסצנטיות בנפרד.
שימו לב אם אות נפלט על ידי הגרעינים. אם אין אות ברור בערוצים הבודדים, אין צורך בהיסוס ספקטרלי. כדי לפתור את האובייקטים הפלואורסצנטיים בשני ערוצי הפלואורסצנטיות, השתמש בשיטת חיסור רקע פלואורסצנטי עם פרמטרים רלוונטיים עבור המדגם ואת הפרמטרים המתאימים לפיצול קצה.
השתמש בתמונות של מונוקולטורה של תאי היעד כדי לקבוע פרמטרים עבור פלואורסצנטיות גרעינית של תאי היעד. השתמש בתמונות של מונוקולטורה של תאים משפיעים כדי ליצור פרמטרים עבור פלואורסצנטיות גרעינית אפופוטוטית הנגרמת על ידי מצע. השתמש בתמונות של תרבות-משנה כדי לאמת או לחדד פרמטרים עבור פלואורסצנטיות גרעינית אפופוטוטית הנגרמת על ידי מצעים בתאי היעד.
כדי לקבוע את הגודל המינימלי של גרעיני היעד, השתמש בתמונות בערוץ אות הגרעינים מה בארות המכילות רק תאי יעד עם מצע מדורג. כדי לקבוע את הגודל הממוצע של גרעיני אפקט אפופוטוטיקה, השתמש בתמונות בערוץ אות המצע מה בארות המכילות רק תאים משפיעים עם מצע מדורג. כדי לספור את מספר גרעיני תאי היעד של הפלואורסצנטיות, הגדר הליך ניתוח באמצעות הגבלת גודל מינימלית מתאימה.
באמצעות תמונות monoculture תא אפקטור, להגדיר הליך ניתוח שני כדי לספור את מספר גרעיני apoptotic כי הם גדולים יותר מהגודל הממוצע של גרעיני אפקט apoptotic. לאחר מכן הגדר הליך ניתוח שלישי כדי לספור את מספר תאי היעד האפטוטיים על-ידי ספירת מספר הגרעינים שבהם אות הגרעין ואות המצע המוגבל בגודלם מאופנים באופן משמעותי. בדרך כלל, תאים סרטניים להגדיל את אות הפלואורסצנטיות בגרעין שלהם בעקבות ההפעלה של biosensor caspase מיקוד גרעיני כאשר התאים ליצור קשר עם CD8 חיובי T-תאים מופעל מראש על ידי נוגדנים בהעדר תאים מדכאים.
גדלי הגרעין של תאי T חיוביים CD8 קטנים יותר מאלה של תאים סרטניים. לכן, תאים אפטוטיים אפקטר ניתן לא לכלול ספירת תאי יעד apoptotic על ידי שיטת ניתוח תמונה הגבלת גודל. למרות כמה תאים סרטניים היעד להפגין צורה מעוגל קטן ללא פלואורסצנטיות מצע, זה לא משפיע על הניתוח.
כמו תאים אלה עוברים מיטוזה ולא אפופטוזיס ולכן אינם נכללים ספירת תאי יעד apoptotic על ידי מסכת חפיפה אות מצע גרעיני. התרבות השיתוף של תאים סרטניים היעד עם מופעל מראש CD8 חיובי T-תאים מגביר אפופטוזיס תאים סרטניים מעל רמות של אפופטוזיס ספונטני מונוקולטורות תאים סרטניים. בדרך כלל, בעת שימוש ביחס אופטימלי של תאים סרטניים היעד לתאי אפקט, שיא במספר תאים סרטניים היעד apoptotic ניתן לראות.
שיא זה הופך להיות ברור יותר כאשר הנתונים מבוטאים כשבר האפטוטי של אוכלוסיית תאי היעד. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה הוא להגדיר monocultures של תאי היעד monocultures של תאים משפיעים לשימוש בפיתוח מסכות ניתוח. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי משך ותדירות תאי T לאינטראקציות תאים סרטניים, והתנאים הקשורים לציטוטוקסיות תלוית גנים בתאי האדם והעכבר.
אנו מפתחים כעת בדיקה זו לתוך מסך תפוקה גבוהה באמצעות תאים אנושיים כדי לזהות תרכובות המעכבות דיכוי חיסוני מתווך תאים מיאלואידים ובכך לשפר את היעילות מעכבי מחסום.
