우리의 프로토콜은 T 세포 유도 종양 세포 세포 사멸증에 있는 골수성 유래 억제기 세포 및 종양 관련 대식세포의 효력을 평가합니다. 잠재적인 치료 내정간섭의 근본적인 기계장치의 조사와 더불어. 이 프로토콜은 T 세포 유발 종양 세포 세포세포를 높은 감도로 직접 평가하고 세포 대 세포 상호 작용의 세로 분석 및 이미징을 가능하게 합니다.
검사점 억제제의 효능은 특정 종양 유형에서 종양 침투 골수성 세포에 의해 가장 잘 살펴보았다. 이 기술은 이 종양을 위한 새로운 치료의 확인으로 이끌어 낼 수 있었습니다. 이 방법은 암 면역학 연구를 발전시킬 뿐만 아니라 면역 결핍 및 자가 면역 질환에 대한 통찰력을 잠재적으로 제공할 수 있었습니다.
비장 절연 CD8 양성 T 세포의 활성화 및 확장을 위해, 첫 번째 알리쿼트는 96웰 U-바닥 플레이트의 개별 우물로 E-DMEM의 50 마이크로리터에서 다섯 번째 CD8 양성 T 세포에 10번 10회. 다음으로, E-DMEM의 50마이크로리터, 또는 E-DMEM의 50 마이크로리터에서 다섯 번째 억제제 세포에 1회 10번을 T 세포각 웰에 추가합니다. 그런 다음 새로 준비된 활성화 배지 50마이크로리터와 관심 있는 테스트 시약의 유무에 관계없이 50마이크로리터의 E-DMEM을 적절한 우물에 추가합니다.
그리고 4 일 동안 95 %의 습도와 37도 섭씨 및 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 사전 활성화된 CD8 양성 T세포 표적 세포 공동 배양을 설정하려면 먼저 1-100 희석 된 성장 인자 감소 용용성 지하 멤브레인 매트릭스 30 마이크로리터를 미세 검사에 적합한 96 웰의 적절한 우물에 추가합니다. 플레이트를 흔들어 매트릭스를 균등하게 펴고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 적어도 1시간 동안 놓는다.
플레이트가 평형화되는 동안 대상 셀을 준비합니다. 매체를 흡습하고 PBS로 세척하고 실온에서 05%의 트립신-EDTA 1밀리리터를 1분간 추가합니다. 부드러운 파이펫팅으로 태아 소 세럼으로 보충된 DMEM의 9밀리리터를 추가하고, 해리된 세포를 튜브로 옮킨다.
세포를 원심 분리 한 후, E-DMEM의 500 마이크로 리터에서 팔레트를 다시 중단합니다. 셀 스트레이너를 통해 다시 중단된 세포를 필터링하고 라이브 셀을 계산합니다. 그런 다음 얼음에 신선한 E-DMEM에서 밀리리터 당 네 번째 표적 세포에 4 배 10으로 밀도를 조정합니다.
다음으로, 미리 활성화된 CD8 양성 T-세포파이펫을 사용하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 재보페하고, 부동 T 세포를 조건당 1.5밀리리터 튜브로 이송한다. 200 마이크로리터의 PBS를 가진 남은 세포를 잘 수집하고, 적절한 1.5 밀리리터 튜브 및 원심분리기로 세초를 옮기십시오. 매체를 흡인하고 원심분리를 위해 각 튜브에 1밀리리터의 E-DMEM을 추가합니다.
원심분리 후, 튜브 당 신선한 E-DMEM의 100 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단. 계산 후, 각 튜브의 세포를 1.6배 10배의 밀도로 조정하여 제5의 사전 활성화된 CD8 양성 T-세포당 배지의 밀리리터당 양수 T-세포를 조절하고, 세포를 얼음 위에 놓는다. 세포가 준비되면, 96웰 현미경 플레이트의 각 우물에서 지하 막 매트릭스를 흡습하고, 혼합과 함께 플레이트의 내부 60 우물 내의 개별 우물에 표적 세포의 50 마이크로리터를 추가한다.
IL2의 밀리리터 당 3단위에 4회 10회 보충된 E-DMEM 25마이크로리터와 10마이크로몰러 형광케-3 기판을 적절한 웰에 첨가한다. 그런 다음 미리 활성화된 CD8 양성 T 세포의 25 마이크로리터를 적절한 우물에 추가합니다. 마지막으로, 적절한 우물에 E-DMEM을 추가하여 최대 100마이크로리터의 총 부피를 만듭니다.
PBS 또는 멸균 물 200마이크로리터를 모든 빈 우물에 넣습니다. 접시를 흔들어 서 10 분 동안 평평한 표면에 접시를 둡니다. 세포를 이미지화하기 위해 현미경을 설정하여 상 대비에서 이미지를 습득합니다.
뿐만 아니라 핵 제한 형광 단백질에 적합한 형광 채널, 및 실험에 사용되는 형광 활성 caspase-3 기질 형광. 그런 다음 각 실험의 이미지를 위상 대비에서 잘 캡처하고 적어도 72 시간 동안 1 ~ 3 시간마다 두 개의 형광 채널을 캡처합니다. 캡처된 이미지를 분석하려면 기판 신호에 사용되는 형광 채널에서 caspase-3 기판없이 표적 세포 및 매체만 을 포함하는 컨트롤에서 이미지를 엽니다.
부적절한 형광 신호가 핵에 의해 방출되는지 관찰한다. 기판 신호가 핵 내에서 명백하다면, 기판 신호가 사라질 때까지 핵 신호에서 제거된 기판 신호의 비율을 증가시키기 위해 스펙트럼 미혼을 사용합니다. 다음으로, 두 형광 채널에서 카스파제-3 기판없이 배지에서 핵만 표지되지 않은 이펙터 세포만을 포함하는 대조군을 잘 본다.
신호가 핵에 의해 방출되는지 관찰한다. 개별 채널에서 신호가 보이지 않으면 스펙트럼 언믹싱이 필요하지 않습니다. 형광 채널 모두에서 형광 물체를 해결하려면 샘플에 대한 관련 매개 변수와 가장자리 분할에 적합한 매개 변수가있는 형광 배경 빼기 방법을 사용합니다.
표적 세포 단배문화의 이미지를 사용하여 표적 세포 핵 형광에 대한 매개 변수를 설정합니다. 이펙터 세포 단배문화의 이미지를 사용하여 기판 유도 세포 핵 형광에 대한 매개 변수를 설정합니다. 공동 배양 의 이미지를 사용하여 표적 세포에서 기판 유도 세포 핵 형광에 대한 매개 변수를 확인하거나 정제합니다.
표적 핵의 최소 크기를 결정하기 위해, 카스파스 기판을 가진 표적 세포만 을 포함하는 우물에서 핵 신호 채널에서 이미지를 사용한다. 세포사멸 효과기 핵의 평균 크기를 결정하기 위해, 카스파제 기판을 가진 이펙터 세포만 을 포함하는 우물에서 기판 신호 채널에서 이미지를 사용한다. 형광 표적 세포 핵의 수를 계산하려면 적절한 최소 크기 제한을 사용하여 분석 절차를 설정합니다.
이펙터 세포 단배기 이미지를 사용하여, 세포 세포 이펙터 핵의 평균 크기보다 더 큰 세포 핵의 수를 계산하기 위해 두 번째 분석 절차를 설정합니다. 그런 다음 핵 신호 및 크기 제한 기질 신호가 현저하게 공동 국소화되는 핵 의 수를 계산하여 세포 형 표적 세포의 수를 계산하는 세 번째 분석 절차를 설정합니다. 전형적으로, 암세포는 세포가 억제제 세포의 부재에서 항체에 의해 미리 활성화된 CD8 양성 T 세포와 접촉할 때 핵 표적화 카스파스 바이오센서의 활성화에 따라 핵에서 형광 신호를 증가시다.
CD8 양성 T 세포의 핵 크기는 암세포의 핵 크기보다 작습니다. 따라서, 세포세포는 크기 제한 영상 분석 방법에 의해 세포세포 수로부터 배제될 수 있다. 일부 표적 암세포는 기질 형광 없이 작은 둥근 모양을 나타내더라도, 이것은 분석에 영향을 미치지 않습니다.
이러한 세포가 세포가 세포사멸보다는 미토시스를 겪고 있기 때문에 핵 기질 신호 중복 마스크에 의해 세포 수에서 제외된다. 사전 활성화된 CD8 양성 T세포를 가진 표적 암세포의 공동 배양은 암세포 단배문화에서 자발적인 세포멸의 수준 이상의 종양 세포 세포 사멸을 증가시킨다. 일반적으로, 표적 암세포의 최적 비율을 이효과를 위한 세포, 세포 세포 에 대한 최적의 비율을 사용할 때, 세포멸 표적 암세포의 수에 있는 피크를 관찰할 수 있다.
이 피크는 데이터가 표적 세포 집단의 세포 분수로 표현될 때 더 뚜렷해집니다. 이 프로토콜을 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 분석 마스크 개발에 사용하기 위해 대상 셀과 이펙터 세포의 단일 배양을 설정하는 것입니다. 이 방법은 암 세포 상호 작용에 T 세포의 기간 및 주파수, 그리고 인간과 마우스 세포 둘 다에 있는 유전자 의존적인 세포 독성과 관련되었던 조건에 통찰력을 제공할 수 있습니다.
현재 이 분석체는 인간 세포를 이용한 고처리량 스크린으로 개발되어 골수성 세포 매개 면역 억제제를 억제하는 화합물을 식별하고 이를 통해 체크포인트 억제제 효능을 향상시키고 있습니다.
