Nosso protocolo avalia os efeitos das células supressoras derivadas do mieloide e dos macrófagos associados ao tumor na apoptose celular induzida por células T. Ao lado da investigação dos mecanismos subjacentes de possíveis intervenções terapêuticas. Este protocolo avalia diretamente a apoptose de células T induzidas por células T com alta sensibilidade e permite análise longitudinal e imagem de interações célula-célula.
A eficácia do inibidor de ponto de verificação é melhor analisada por células mielóides infiltradas por tumores em certos tipos de tumores. Essa técnica pode levar à identificação de novas terapias para esses tumores. Esse método poderia não apenas avançar na pesquisa de imunologia do câncer, mas poderia potencialmente também fornecer insights sobre a imunodeficiência e doenças autoimunes.
Para a ativação e expansão de células T isoladas de baço, a primeira alíquota é de uma vez 10 para a quinta célula T CD8 positiva em 50 microliters de E-DMEM em poços individuais de uma placa de fundo U de 96 poços. Em seguida, adicione uma vezes 10 às quintas células supressoras em 50 microliters de E-DMEM, ou 50 microliters de E-DMEM sozinho, em cada poço de células T. Em seguida, adicione 50 microliters de meio de ativação recém-preparado e 50 microliters de E-DMEM, com ou sem os reagentes de teste de interesse, aos poços apropriados.
E coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com 95% de umidade por quatro dias. Para configurar uma co-cultura de células-T pré-ativada CD8-positiva, adicione primeiro 30 microliters de 1 a 100 diluídos de membrana de porão solúvel reduzida pelo fator de crescimento aos poços apropriados de uma placa de fundo plano de 96 poços, adequada para microscopia. Agite a placa para espalhar a matriz uniformemente, e coloque a placa na incubadora de cultura celular por pelo menos uma hora.
Enquanto a placa está equilibrando, prepare as células-alvo. Aspire o médio, lave com PBS e adicione um mililitro de 05% Trypsin-EDTA à temperatura ambiente por um minuto. Adicione nove mililitros de DMEM suplementados com soro bovino fetal por tubulação suave, e transfira as células dissociadas em tubos.
Depois de centrifugar as células, resuspense a palete em 500 microliters de E-DMEM. Filtre as células resuspended através de um coador celular, e conte as células vivas. Em seguida, ajuste a densidade para quatro vezes 10 para as células-alvo quarta por mililitro em E-DMEM fresco no gelo.
Em seguida, pipeta as células T pré-ativadas CD8-positivas algumas vezes para resuspensar as células em uma única suspensão celular, e transferir as células T flutuantes para um tubo de 1,5 mililitro por condição. Colete todas as células restantes com 200 microliters de PBS por poço, transfira as lavagens para os tubos apropriados de 1,5 mililitro e centrífuga. Aspire o meio e adicione um mililitro de E-DMEM a cada tubo para centrifugação.
Após a centrifugação, resuspenja as pelotas em 100 microliters de E-DMEM fresco por tubo. Após a contagem, ajuste as células em cada tubo para uma densidade de 1,6 vezes 10 para a quinta célula T pré-ativada CD8-positiva por mililitro de médio, e coloque as células no gelo. Quando as células estiverem prontas, aspire a matriz de membrana do porão de cada poço da placa de microscopia de 96 poços, e adicione 50 microliters de células-alvo a poços individuais dentro dos 60 poços internos da placa com mistura.
Adicione 25 microliters de E-DMEM complementados com quatro vezes 10 às terceiras unidades por mililitro de IL2, e 10 micromolars de caspase-3 fluorogênicas aos poços apropriados. Em seguida, adicione 25 microliters de células T cd8-positivas pré-ativadas aos poços apropriados. E, finalmente, adicione E-DMEM aos poços apropriados para fazer um volume total de até 100 microliters.
Adicione 200 microliters de PBS ou água estéril em todos os poços vazios. Agite a placa e deixe a placa em uma superfície plana por 10 minutos. Para imaginar as células, defina o microscópio para adquirir imagens em contraste de fase.
Assim como os canais de fluorescência adequados para a proteína fluorescente nuclear restrita, e os fluorogênicos ativados caspase-3 fluoroforos usados no experimento. Em seguida, capture imagens de cada poço experimental em contraste de fase e os dois canais de fluorescência a cada uma ou três horas por pelo menos 72 horas. Para analisar as imagens capturadas, abra uma imagem de um poço de controle contendo apenas células-alvo e meio sem substrato caspase-3 no canal de fluorescência usado para sinal de substrato.
Observe se um sinal de fluorescência inadequado está sendo emitido pelos núcleos. Se o sinal do substrato for aparente dentro dos núcleos, use descomprturação espectral para aumentar a porcentagem de sinal de substrato removido do sinal dos núcleos, até que o sinal do substrato desapareça. Em seguida, veja um poço de controle contendo apenas núcleos de células efetivas sem rótulo no meio sem substrato caspase-3 nos dois canais de fluorescência individualmente.
Observe se um sinal é emitido pelos núcleos. Se nenhum sinal for aparente nos canais individuais, não é necessário descompração espectral. Para resolver os objetos fluorescentes em ambos os canais de fluorescência, use um método de subtração de fundo de fluorescência com parâmetros relevantes para a amostra e os parâmetros apropriados para a divisão da borda.
Use imagens da monocultura celular alvo para estabelecer parâmetros para fluorescência nuclear de células-alvo. Use imagens da monocultura celular efetiva para estabelecer parâmetros para fluorescência nuclear apoptótica induzida por substrato. Use imagens de co-cultura para verificar ou refinar parâmetros para fluorescência nuclear apoptótica induzida por substrato em células-alvo.
Para determinar o tamanho mínimo dos núcleos alvo, use imagens no canal de sinal dos núcleos dos poços contendo apenas células-alvo com substrato de caspase. Para determinar o tamanho médio dos núcleos de efeitos apoptóticos, use imagens no canal de sinal substrato dos poços contendo apenas células efeito ou com substrato de caspase. Para contar o número de núcleos celulares alvo de fluorescência, configure um procedimento de análise usando uma restrição de tamanho mínimo apropriada.
Utilizando imagens de monocultura celular efeitoor, configure um segundo procedimento de análise para contar o número de núcleos apoptóticos que são maiores do que o tamanho médio dos núcleos de efeito apoptótico. Em seguida, configure um terceiro procedimento de análise para contar o número de células-alvo apoptóticas contando o número de núcleos em que o sinal do núcleo e o sinal de substrato restrito de tamanho co-localizam significativamente. Normalmente, as células cancerígenas aumentam o sinal de fluorescência em seus núcleos após a ativação de um biosensor de caspase de alvo nuclear quando as células fazem contato com células T CD8 positivas pré-ativadas por anticorpos na ausência de células supressoras.
Os tamanhos do núcleo das células T CD8 positivos são menores do que os das células cancerosas. Assim, as células efeitos apoptóticas podem ser excluídas da contagem de células-alvo apoptóticas por um método de análise de imagem de restrição de tamanho. Embora algumas células cancerígenas alvos apresentem uma pequena forma arredondada sem fluorescência de substrato, isso não afeta a análise.
Como essas células estão sofrendo mitose em vez de apoptose e, portanto, são excluídas da contagem de células-alvo apoptóticas por uma máscara de sobreposição de sinal de substrato nuclear. A co-cultura de células cancerígenas-alvo com células T pré-ativadas CD8-positivas aumenta a apoptose das células tumorais acima dos níveis de apoptose espontânea em monoculturas de células cancerosas. Geralmente, ao usar uma proporção ideal de células cancerígenas-alvo para células efetivas, um pico no número de células cancerígenas alvo apoptóticas pode ser observado.
Esse pico se torna mais distinto quando os dados são expressos como a fração apoptótica da população celular alvo. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este protocolo é configurar monoculturas de células-alvo e monoculturas de células effectoras para uso no desenvolvimento das máscaras de análise. Este método pode fornecer uma visão da duração e frequência das células T às interações de células cancerosas, e as condições associadas à citotoxicidade dependente de genes em células humanas e camundongos.
No momento, estamos desenvolvendo este ensaio em uma tela de alta produtividade usando células humanas para identificar compostos que inibem a imunossupressão mediada por células mieloides e, assim, aumentam a eficácia do inibidor de ponto de verificação.
