cd8⁺ t 细胞诱导体外肿瘤细胞凋亡的实时检测--研究肿瘤浸润髓内细胞的免疫抑制作用

我们的协议评估了骨髓衍生抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞在T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的影响。除了调查潜在治疗干预的基本机制。该协议直接评价T细胞诱导肿瘤细胞凋亡的高灵敏度，并实现细胞与细胞相互作用的纵向分析和成像。

在某些肿瘤类型中，通过肿瘤渗透骨髓细胞来观察检查点抑制剂的疗效。这项技术可以鉴定这些肿瘤的新疗法。这种方法不仅可以促进癌症免疫学研究，而且有可能为免疫缺陷和自身免疫性疾病提供见解。

对于脾脏分离CD8阳性T细胞的激活和膨胀，首先将50微升E-DMM的50微升中第5个CD8阳性T细胞的1倍10分等到10倍，进入96孔U型底板的单个孔中。接下来，在50微升E-DMEM中，或单独将50微升E-DMEM中的第五抑制细胞中，将1倍10添加到T细胞的每个井中。然后，将50微升新鲜准备的激活介质和50微升的E-DMEM，有或没有感兴趣的测试试剂，到适当的井。

将板放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中，湿度为95%，为期四天。要建立预激活的CD8阳性T细胞靶细胞共培养物，首先将30微升1至100稀释生长因子-减少的可溶性基底膜基质加入96孔平底板的适当孔中，适合显微镜。摇动板以均匀分布基质，将板放在细胞培养培养箱中至少一小时。

当板是平衡时，准备目标单元。吸气介质，用PBS清洗，并在室温下加入1毫升05%的三辛-EDTA一分钟。加入9毫升DMEM，辅以胎儿牛血清，通过温和的移液，并将分离的细胞转移到管中。

离心细胞后，在 500 微升 E-DMEM 中重新装空托盘。通过细胞滤株过滤重新暂停的细胞，并计算活细胞。然后将密度调整为四倍10至第四目标细胞每毫升在新鲜的E-DMEM在冰上。

接下来，移液预激活的CD8阳性T细胞几次，将细胞重新悬浮到单个细胞悬浮液中，并转移浮动T细胞到一个1.5毫升管每个条件。收集每井200微升PBS的剩余细胞，将洗涤液转移到适当的1.5毫升管中，并离心机。吸气介质，并在每个管中加入一毫升E-DMEM，用于离心。

离心后，每管100微升新鲜E-DMEM的颗粒重新下水。计数后，将每个管中的细胞调整到每毫升介质中第五个预激活的CD8阳性T细胞的密度为1.6倍10，然后将细胞放在冰上。当细胞准备就绪时，从96孔显微镜板的每个孔中吸出基底膜基质，并将50微升的目标细胞添加到板内60孔内的单个孔中混合。

将 25 微升 E-DMEM 补充 4 倍至每毫升 IL2 的 4 倍至第三单位，并在适当的井中加入 10 微摩尔氟基质卡斯帕塞-3 基板。然后将25微升预激活的CD8阳性T细胞添加到相应的孔中。最后，将E-DMEM添加到相应的油井中，使总体积达到100微升。

在所有空井中加入200微升PBS或无菌水。摇动板，将板放在平坦的表面上 10 分钟。要对细胞进行成像，请将显微镜设置为在相位对比度中获取图像。

以及适用于核限制荧光蛋白的荧光通道，以及实验中使用的氟源活性卡斯帕塞-3基质荧光。然后，在相位对比度和两个荧光通道中每 1 到 3 小时捕获一次实验井的图像，至少 72 小时。要分析捕获的图像，请从控制井中打开一个图像，该控制井中仅包含目标细胞和介质，在用于基板信号的荧光通道中没有 caspase-3 基板。

观察核是否发出不适当的荧光信号。如果基板信号在原子核内明显，则使用光谱解混来增加从核信号中移除的基板信号的百分比，直到基板信号消失。接下来，在两个荧光通道中单独查看一个控制井，该控制井只包含介质中未标记效应细胞，而无 caspase-3 基板。

观察信号是否由核发出。如果单个通道中没有明显信号，则不需要频谱解混。要解析两个荧光通道中的荧光对象，请使用荧光背景减法，该方法具有样品的相关参数和边缘分割的适当参数。

利用目标细胞单培养的图像建立目标细胞核荧光参数。利用效应器细胞单培养的图像建立基底诱导凋亡核荧光的参数。使用共培养物的图像验证或优化目标细胞中基底诱导凋亡核荧光的参数。

要确定目标核的最小大小，请使用核信号通道中仅包含具有卡斯帕塞基板的井中的图像。要确定凋亡效应器核的平均大小，请使用基板信号通道中仅包含具有卡斯帕塞基板的效应细胞的孔中的图像。要计算荧光靶细胞核的数量，请使用适当的最小大小限制设置分析程序。

使用效应器细胞单培养图像，设置第二个分析过程，以计算大于凋亡效应极核平均大小的凋亡核数。然后建立第三个分析程序，通过计算核信号和大小受限基质信号显著共同定位的核数来计算凋亡目标细胞的数量。通常，当细胞在没有抑制细胞的情况下与抗体预激活的CD8阳性T细胞接触时，癌细胞在激活核靶基后，其核细胞中的荧光信号增加。

CD8阳性T细胞的核大小比癌细胞小。因此，通过大小限制图像分析方法，可以从凋亡靶细胞计数中排除凋亡效应细胞。虽然一些目标癌细胞表现出小圆的形状没有基质荧光，但这并不影响分析。

由于这些细胞正在经历线粒体，而不是凋亡，因此被核基板信号重叠掩码排除在凋亡靶细胞计数之外。目标癌细胞与预激活的CD8阳性T细胞的共培养使肿瘤细胞凋亡高于癌细胞单培养的自发凋亡水平。通常，当使用靶向癌细胞的最佳比例来影响细胞时，可以观察到凋亡靶癌细胞数量的峰值。

当数据表示为目标细胞总体的凋亡分数时，此峰值变得更加明显。尝试此协议时，要记住的最重要的事情是建立目标细胞的单一培养和效应器细胞的单培养，用于开发分析掩码。这种方法可以提供对T细胞与癌细胞相互作用的持续时间和频率的洞察，以及与人类和小鼠细胞中基因依赖性相关的条件。

我们目前正在开发这种检测到高通量的屏幕使用人类细胞，以确定化合物，抑制骨髓细胞中位免疫抑制，从而提高检查点抑制剂的功效。