Nuestro protocolo evalúa los efectos de las células supresoras derivadas de mieloides y los macrófagos asociados al tumor en la apoptosis de células tumorales inducidas por células T. Junto con la investigación de los mecanismos subyacentes de las posibles intervenciones terapéuticas. Este protocolo evalúa directamente la apoptosis de células tumorales inducida por células T con alta sensibilidad y permite el análisis longitudinal y la toma de imágenes de interacciones de célula a célula.
La eficacia del inhibidor del punto de control se examina mejor mediante células mieloides infiltrantes de tumores en ciertos tipos de tumores. Esta técnica podría conducir a la identificación de nuevas terapias para estos tumores. Este método no sólo podría avanzar en la investigación de inmunología del cáncer, sino que potencialmente también podría proporcionar información sobre la inmunodeficiencia y las enfermedades autoinmunes.
Para la activación y expansión de células T CD8-positivas aisladas del bazo, primero aliquot una vez 10 a las quintas células T positivas CD8 en 50 microlitros de E-DMEM en pozos individuales de una placa inferior en U de 96 pozos. A continuación, agregue una por 10 a las quintas células supresoras en 50 microlitros de E-DMEM, o 50 microlitros de E-DMEM solos, en cada pozo de células T. A continuación, añada 50 microlitros de medio de activación recién preparados y 50 microlitros de E-DMEM, con o sin los reactivos de prueba de interés, a los pozos apropiados.
Y coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados y 5% con 95% de humedad durante cuatro días. Para establecer un co-cultivo de células de destino de células T CD8 previamente activados, agregue primero 30 microlitros de matriz de membrana de sótano soluble diluida por factor de crecimiento diluida de 1 a 100 a los pozos apropiados de una placa de fondo plano de 96 pozos, adecuada para microscopía. Agitar la placa para extender la matriz uniformemente, y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante al menos una hora.
Mientras la placa se está equilibrando, prepare las células de destino. Aspirar el medio, lavar con PBS y añadir un mililitro de 05%Trypsin-EDTA a temperatura ambiente durante un minuto. Añadir nueve mililitros de DMEM complementados con suero bovino fetal por pipeteo suave, y transferir las células disociadas en tubos.
Después de centrifugar las células, resuspender el palet en 500 microlitros de E-DMEM. Filtre las células resuspendidas a través de un colador celular y cuente las células vivas. Luego ajuste la densidad a cuatro veces 10 a las cuartas células diana por mililitro en E-DMEM fresco sobre hielo.
A continuación, pipetee las células T CD8 preactivadas varias veces para resuspender las células en una sola suspensión de celda, y transferir las células T flotantes en un tubo de 1,5 mililitros por condición. Recoger las células restantes con 200 microlitros de PBS por pozo, transferir los lavados a los tubos de 1,5 mililitros apropiados, y centrífuga. Aspirar el medio y añadir un mililitro de E-DMEM a cada tubo para centrifugación.
Después de la centrifugación, resuspender los pellets en 100 microlitros de E-DMEM fresco por tubo. Después de contar, ajuste las células de cada tubo a una densidad de 1,6 veces 10 a las quintas células T CD8 preactivadas por mililitro de medio, y coloque las células en hielo. Cuando las células estén listas, aspirar la matriz de membrana del sótano de cada pozo de la placa de microscopía de 96 pozos, y añadir 50 microlitros de células diana a pozos individuales dentro de los 60 pozos internos de la placa con mezcla.
Añadir 25 microlitros de E-DMEM complementados con cuatro veces 10 a las terceras unidades por mililitro de IL2, y sustrato de caspasa-3 fluorogénica de 10 micromolares a los pozos apropiados. Luego agregue 25 microlitros de células T CD8 preactivadas a los pozos apropiados. Y por último, agregue E-DMEM a los pozos apropiados para hacer un volumen total de hasta 100 microlitros.
Agregue 200 microlitros de PBS o agua estéril a todos los pozos vacíos. Agitar la placa y dejar la placa sobre una superficie plana durante 10 minutos. Para crear una imagen de las celdas, configure el microscopio para que adquiera imágenes en contraste de fase.
Así como canales de fluorescencia adecuados para la proteína fluorescente restringida nuclear, y los fluoróforos de sustrato de caspase-3 activados fluorogénicos utilizados en el experimento. A continuación, capture imágenes de cada pozo experimental en contraste de fase y los dos canales de fluorescencia cada una o tres horas durante al menos 72 horas. Para analizar las imágenes capturadas, abra una imagen desde un pozo de control que contenga únicamente celdas de destino y medio sin sustrato de caspasa-3 en el canal de fluorescencia utilizado para la señal de sustrato.
Observe si los núcleos emiten una señal de fluorescencia inapropiada. Si la señal de sustrato es aparente dentro de los núcleos, utilice la desmezcla espectral para aumentar el porcentaje de señal de sustrato eliminada de la señal de núcleos, hasta que la señal del sustrato desaparezca. A continuación, vea un pozo de control que contenga solo núcleos células efectores sin etiquetar en medio sin sustrato de caspase-3 en los dos canales de fluorescencia individualmente.
Observe si los núcleos emiten una señal. Si no hay ninguna señal aparente en los canales individuales, no es necesario desmezclar espectral. Para resolver los objetos fluorescentes en ambos canales de fluorescencia, utilice un método de resta de fondo de fluorescencia con parámetros relevantes para la muestra y los parámetros adecuados para la división de aristas.
Utilice imágenes del monocultivo de células de destino para establecer parámetros para la fluorescencia nuclear de células de destino. Utilice imágenes del monocultivo de células efectores para establecer parámetros para la fluorescencia nuclear apoptótica inducida por sustratos. Utilice imágenes de coculrío para verificar o refinar parámetros para la fluorescencia nuclear apoptótica inducida por sustratos en las células diana.
Para determinar el tamaño mínimo de los núcleos de destino, utilice imágenes en el canal de señal de núcleos de los pozos que contienen sólo células diana con sustrato de caspasa. Para determinar el tamaño medio de los núcleos de efector apoptótico, utilice imágenes en el canal de señal de sustrato de los pozos que contienen sólo células efectores con sustrato de caspasa. Para contar el número de núcleos de celda de destino de fluorescencia, configure un procedimiento de análisis utilizando una restricción de tamaño mínimo adecuada.
Mediante imágenes de monocultivo de células de efector, configure un segundo procedimiento de análisis para contar el número de núcleos apoptóticos que son mayores que el tamaño medio de los núcleos de efector apoptótico. A continuación, establezca un tercer procedimiento de análisis para contar el número de células diana apoptóticas contando el número de núcleos en los que la señal del núcleo y la señal de sustrato restringida en tamaño se co-localizan significativamente. Típicamente, las células cancerosas aumentan la señal de fluorescencia en sus núcleos después de la activación de un biosensor de caspasa de orientación nuclear cuando las células hacen contacto con células T CD8 positivas preactivadas por anticuerpos en ausencia de células supresoras.
Los tamaños de núcleo de las células T CD8 positivas son más pequeños que los de las células cancerosas. Por lo tanto, las celdas de efector apoptótico se pueden excluir de los recuentos de celdas de destino apoptóticas mediante un método de análisis de imagen de restricción de tamaño. Aunque algunas células cancerosas diana exhiben una pequeña forma redondeada sin fluorescencia de sustrato, esto no afecta el análisis.
Como estas células están siendo sometidas a mitosis en lugar de apoptosis y por lo tanto se excluyen del recuento de células diana apoptóticas por una máscara de superposición de señal de sustrato nuclear. El cocultivo de las células cancerosas diana con células T CD8 preactivadas aumenta la apoptosis celular tumoral por encima de los niveles de apoptosis espontánea en los monocultivos de células cancerosas. Generalmente, cuando se utiliza una relación óptima de células cancerosas diana a células efectora, se puede observar un pico en el número de células cancerosas diana apoptóticas.
Este pico se vuelve más distinto cuando los datos se expresan como la fracción apoptótica de la población de células de destino. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo es configurar monocultivos de células diana y monocultivos de células efectores para su uso en el desarrollo de las máscaras de análisis. Este método puede proporcionar información sobre la duración y frecuencia de las interacciones de células T a células cancerosas, y las condiciones asociadas con la citotoxicidad dependiente del gen en las células humanas y del ratón.
Actualmente estamos desarrollando este ensayo en una pantalla de alto rendimiento utilizando células humanas para identificar compuestos que inhiben la inmunosupresión mediada por células mieloides y, por lo tanto, mejoran la eficacia de los inhibidores de puntos de control.
