مقدمة.الخلايا الآكلة للعظم هي نوع من الخلايا متعددة النوى يشيع استخدامها من قبل الباحثين في مجالات مثل أبحاث أمراض العظام وأبحاث السرطان وهندسة الأنسجة وأبحاث الأطراف الاصطناعية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تمايز ناقضة العظم أمرا صعبا ، لأن اندماج السلائف ضروري. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تمايز الخلايا الآكلة للعظم البشري عن IPSCs استخدام مجموعة متنوعة من العوامل البيولوجية في الوقت المناسب.
عندما يتعلق الأمر بالخلايا الأولية البشرية. CD34 + خلايا الدم أحادية النواة المحيطية هي حاليا أكثر أنواع الخلايا استخداما للتمايز إلى ناقضات العظم. ومع ذلك ، فإن هذا النهج محدود بسبب عدم التجانس داخل مجموعة CD34 + وقابليتها المحدودة للتوسع.
تقدم IPSCs البشرية مصدرا بديلا ل osteoclasts . نظرا لأنه يمكن نشرها إلى أجل غير مسمى ، فإنها تسمح بتوسيع ورفع مستوى إنتاج ناقضة العظم. هذا يسمح بالتمايز بين أعداد كبيرة من ناقضات العظم ، مما يسهل أبحاث ناقضة العظم.
هنا ، يوضح ألكسندر بلومكي ، طالب ما بعد الدكتوراه وطالبة الدكتوراه جيسيكا سيمون ، تمايز الخلايا الآكلة للعظم عن IPSCs البشرية التي تمر IPSCs. ابدأ في تمرير IPSCs عن طريق إزالة المناطق أو المناطق المتمايزة التي تحتوي على العديد من مجاميع IPSC الميتة تحت المجهر المجسم باستخدام طرف ماصة P-10 أو P-20 أو مكشطة خلية. ستظهر المناطق المتباينة أكثر كثافة وبياضا في اللون.
اغسل الخلايا المنفصلة بوسط قديم ، ثم اغسل أي خلايا منفصلة متبقية باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من خمس وحدات لكل ملليلتر dispase لكل بئر إلى البئر. يمكن ملاحظة حواف المستعمرات التي ترفع من الطبق تحت المجهر المجسم بعد ثلاث إلى خمس دقائق.
قم بإزالة الفاصل بعناية وأضف ملليلتر واحد من DMEM / F-12 مع HEPES 15 مليمولار. استخدم أداة تمرير الخلايا الجذعية أو رافع الخلايا القابل للتصرف لقطع الركام إلى حجم صغير. انقل الوسائط ذات الركام إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر أو P-1000 بطرف عريض التجويف.
اشطف البئر باستخدام DMEM / F-12 وانقل الوسائط إلى الأنبوب سعة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي شرائح IPSC المجاميع في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية باستور وأضف ملليلتر من الوسط البشري الخالي من مصل IPSC لإزاحة وإعادة تعليق IPSCs باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر أو P-1000 مع أطراف عريضة التجويف.
نضح مستخلص الغشاء القاعدي المتبقي من ألواح الآبار المطلية مسبقا ، وأضف ملليلتر واحد من الوسط البشري الخالي من مصل IPSC إلى كل بئر من الصفيحة ذات الستة آبار. نقل IPSCs إلى آبار جديدة من صفيحة من ستة آبار بحيث يكون الحجم النهائي 2 ملليلتر من الوسط البشري الخالي من مصل IPSC لكل بئر باستخدام P-1000 مع أطراف واسعة التجويف. اعتمادا على خط IPSC ، يجب تحسين نسب الانقسام.
هنا ، تم استخدام نسبة تقسيم 1: 6. قم بتدوير لوحة البئر لتوزيع الخلايا بالتساوي عبر اللوحة بعد نقل الركام. تحريض الجسم الجنيني.
استنشاق الوسيط القديم من ثقافات IPSC وشطف الآبار باستخدام DPBS. أضف نصف ملليلتر من التسخين المسبق إلى درجة حرارة الغرفة في كل بئر من صفيحة من ستة آبار وقم بتدوير وعاء الاستزراع لتغطية سطح البئر بالكامل. احتضان وعاء الاستزراع عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ثماني دقائق.
قم بإزالة الوعاء من الحاضنة ، ونضح المحلول ، وأضف المرحلة الأولى من الوسط إلى الآبار التي تتكون من 50 نانوجرام لكل مليلتر من البروتين المورفوني للعظام البشرية 4 ، و 50 نانوجرام لكل مليلتر من عامل نمو بطانة الأوعية الدموية البشرية 165 ، و 20 نانوجرام لكل مليلتر من عامل الخلايا الجذعية البشرية ، ومثبط 10 ميكرومولار ROCK Y-27632. افصل الخلايا برفق عن طريق شطف البئر بوسط المرحلة الأولى. اسحب الخلايا إلى أنبوب مخروطي.
أضف وسيطا جديدا من المرحلة الأولى إلى الآبار وافصل أي خلايا متبقية باستخدام مكشطة خلية. بعد نقل جميع الخلايا إلى الأنبوب ، قم باستخدام جهاز طرد مركزي عند 200 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. نضح وإعادة تعليق الخلايا في ما مجموعه 2 ملليلتر من المرحلة المتوازنة مسبقا وسط واحد.
عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو جهاز عد الخلايا الآلي البذور 12،500 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا ذات قاع دائري للغاية في 100 ميكرولتر من وسط المرحلة الأولى. تحت المجهر ، ستظهر الخلايا بشكل منتشر في جميع أنحاء المحلول. أجهزة الطرد المركزي لوحات 96 بئرا لمدة ثلاث دقائق عند 100 غرام بعد الطرد المركزي ، يجب أن تبدأ الخلايا في تشبه الأجسام الكروية عند عرضها تحت المجهر.
ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. قم بتغيير نصف الوسيط في اليوم الأول واليوم الثاني باستخدام وسائط المرحلة الأولى. استخدم ماصة متعددة القنوات للتخلص من الوسيط القديم في طبق بتري.
بعد التخلص من الوسائط من لوحة 96 بئرا ، تحقق من وجود EBs التي ربما تمت إزالتها عن طريق الخطأ. قم بنقل EBs التي تمت إزالتها عن طريق الخطأ في طبق Petri مرة أخرى باستخدام تمايز المكونة للدم P-1000 الماصة. قبل ملء الآبار من صفيحة من ستة آبار مع ثلاثة ملليلتر من المرحلة الثانية المتوسطة ، والتي يضاف إليها اثنين من المليمولار ultraglutamine ، 55 ميكرومولار بيتا ميركابتوإيثانول ، 25 نانوغرام لكل مليلتر ، interleukin-3 البشري ، و 100 نانوغرام لكل مليلتر عامل تحفيز مستعمرة البلاعم البشرية.
باستخدام P-1000 وطرف عريض التجويف ، انقل ثمانية EBs إلى كل بئر من صفيحة الآبار الستة. بعد النقل ، تحقق بالعين تحت المجهر الاستريو من وجود ثمانية EBs في كل بئر. بعد خمسة إلى سبعة أيام ، يجب أن تصبح مجموعة الخلايا العائمة المكونة من الخلايا المكونة للدم مرئية.
يمكن أن تختلف فترة تمايز المكونة للدم ، بدءا من سبعة أيام. أظهر التمايز لمدة 10 أيام مجموعة مكونة للدم تتكون من مجموعات سكانية كبيرة CD45 + CD14 + و CD11b + مجموعات فرعية. بعد خمسة أيام من العلاج بالمرحلة الثانية المتوسطة ، قم بإجراء تغيير متوسط عن طريق إزالة الوسط القديم بعناية وتوزيعه في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.
أضف على الفور ملليلتر واحد من المرحلة الثانية المتوسطة الجديدة إلى الآبار. من أجل حفظ أي خلايا مكونة للدم عائمة قد تكون موجودة بالفعل ، قم بتدوير الأنبوب بالوسط القديم عند 300 جم لمدة خمس دقائق. أضف وسيطا جديدا من المرحلة الثانية إلى الأنبوب وأعد تعليقه لفصل الخلايا التي ربما تم نقلها باستخدام الوسط القديم.
أضف ملليلتر من وسط المرحلة الثانية الجديد مع الخلايا المحفوظة في كل بئر ، والتي كانت مملوءة مسبقا بملليلتر واحد من وسط المرحلة الثانية. في اليوم العاشر من تمايز المكونة للدم ، يتم حصاد الخلايا المكونة للدم العائمة عن طريق جمعها في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ويمكن تجميدها مرة أخرى باستخدام 10٪ DMSO و 50٪ FBS و 40٪ متوسطة ، أو استخدامها على الفور لزيادة تمييز الخلايا إلى ناقضات عظمية. نضوج M-CSF وتمايز ناقضة العظم.
خلايا البذور في 200،000 خلية لكل سنتيمتر مربع ومعالجتها لمدة ثلاثة أيام مع ألفا MEM تستكمل مع 10 ٪ FBS و 50 نانوغرام لكل مليلتر M-CSF. من أجل إجراء فحوصات وظيفية أو تصوير ، افصل الخلايا الناضجة MCSF عن طريق الغسيل باستخدام P-1000 بطرف عريض التجويف. انقل الخلايا المنفصلة ذات الوسط القديم إلى أنبوب وقم بتدويرها لأسفل عند 300 جم لمدة خمس دقائق.
أعد تعليق وإذابة حبيبات الخلية باستخدام ألفا MEM الطازج المكمل ب 10٪ FBS ، و 50 نانوجرام لكل مليلتر M-CSF ، و 80 نانوجرام لكل ملليلتر RANK ligand. إعادة زرع الخلايا بمعدل 200،000 خلية لكل سنتيمتر مربع وتمايزها لمدة سبعة إلى تسعة أيام. عادة ما تظهر الخلايا الآكلة للعظم متعددة النوى في حوالي اليوم الخامس إلى السابع.
النتائج التمثيلية. يمكن تحليل تكوين مجموعة الخلايا المكونة للدم المتولدة باستخدام قياس التدفق الخلوي. هنا ، تظهر الخلايا المكونة للدم عددا كبيرا من خلايا السلائف CD45 +.
عادة ما تشكل مجموعات الخلايا التي تعبر عن علامات الوحيدات CD14 و CD11b ثلث إجمالي السكان عند مقارنتها بضوابط النمط المتماثل. يمكن رؤية ناقضة العظم المستمدة من IPSC المتمايزة نهائيا تحت المجهر كخلايا متعددة النوى إيجابية TRAP. يظهر الفحص المجهري متحد البؤر تلطيخ الخلايا للكاثيبسين K.تسمح المقايسات الوظيفية مثل مقايسات امتصاص العظام أو المعادن بمزيد من التحديد الكمي لنشاط ناقضة العظم.
هنا ، تظهر حفر الارتشاف بعد إزالة ناقضة العظم الناضجة بنسبة 10٪ مبيض قبل التصوير ، في حين أن سلائف ناقضة العظم الناضجة M-CSF المعالجة دون إضافة ليجند RANK لا تظهر حفر ارتشاف. استنتاج. يتيح هذا البروتوكول التمايز القوي والموثوق بين الخلايا الآكلة للعظم البشري ويمكن أن يوفر حلا جاهزا لأمراض العظام أو الأمراض التي تنطوي على تكلس زائد. نحن نستخدم الخلايا الآكلة للعظم لمزيد من الهندسة في خلايا RANK الخاصة بنا والتي تستخدم مجال إشارات داخل الخلايا يمكن تنشيطه جنبا إلى جنب مع محفز كيميائي للتثبيط من أجل تنشيط ناقضة العظم الخاضعة للرقابة والمستقلة عن تنبعة العظم.
