نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري

اعتلال الشبكية السكري هو المضاعفات الوعائية الدقيقة الأكثر شيوعًا لمرض السكري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الفيزيولوجيا المرضية من المرحلة النهائية مرض الانتشاري اعتلال الشبكية السكري. هذه التقنية تسمح تفكيك المناظر الطبيعية الأصلية الأنسجة ثلاثية الأبعاد والتحقيق في علم الفيزيولوجيا في الأنسجة في المواد المريضة الحية ذات الصلة السريرية المباشرة. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل عن الجراحة والأجهزة المستخدمة في التشريح. للبدء، ضع الأنسجة الليفية التي تم استئصالها من الأشخاص البشريين الذين يخضعون لجراحة الدماغ المجهرية عبر التنانين في طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على PBS العقيم. باستخدام مجهر ستيريو تشريح تستقيم، وقطع الأنسجة الليفية إلى ما يقرب من قطعة ملليمتر مربع واحد. غمر الأنسجة في برنامج تلفزيوني وعقد الأنسجة في مكان مع ملاقط تشريح الدقيقة. جعل تخفيضات واضحة في الأنسجة مع مشرط معقمة مع الحرص على تجنب تمزق الأنسجة الليفية. ضع كل قطعة فردية من الأنسجة في بئر من 12 بئر خلية لوحة ثقافة تحتوي على ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. أولا، إعداد 25 aliquots ميكرولتر من محلول الفيبرينوجين في درجة حرارة الغرفة. ضع قطعة واحدة من الأنسجة الليفية الوعائية في وسط بئر 24 بئراً وأزل أي برنامج PBS الزائد. المقبل، إضافة 25 ميكرولترات من TA حل إلى واحدة من aliquots الفيبرينوجين أعدت. وباستخدام ماصة أخرى تعيين إلى 50 ميكروليترس مزيج عن طريق الأنابيب. الاستغناء عن الخليط على قطعة من الأنسجة الليفية والماصات صعودا وهبوطا لضمان وجود قطعة الأنسجة داخل قطرات. يتم اختبار الوقت من تشكيل الفيبرينوجين حاسمة لأبعاد ثلاثة من ثقافة الجسم الحي السابق، في الأنسجة السابقة قطرة فارغة كما هو موضح في البروتوكول. احتضان اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية. بعد 30 إلى 60 دقيقة إمالة لوحة للتحقق من أن يتم تشكيل هلام الفيبرين تماما. المقبل, تراكب الهلام الفايبرين الأنسجة الليفية الفايبرين مع السابقين فيفو ثقافة المتوسطة تكملها aprotinin. بعد ذلك، إرجاع لوحات الثقافة إلى حاضنة ثقافة الخلية للفترة الزمنية المطلوبة. أولاً، استبدل وسيط ثقافة vivo السابق بميليلتر واحد من محلول ما قبل شكلي كل بئر لإصلاح الثقافات. بعد ساعة واحدة، شطف المواد الهلامية مع ثلاثة خمس دقائق برنامج تلفزيوني يغسل. بعد ذلك، استبدل غسل PBS بمليلترين من محلول أزيد الصوديوم في البئر. تخزين المواد الهلامية الثابتة في أربع درجات مئوية.استخدم ملعقة حافة الفولاذ المقاوم للصدأ مربعة لرفع قطرات من لوحة بعناية، بدءا من الحواف قبل رفع مركز قطرة. باستخدام ملعقة مستديرة ذات حواف نقل قطرات إلى آبار فردية من 12 بئر لوحة تحتوي على ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، إمالة لوحة على الدعم و postfix قطرات مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة الأسيتون الميثانول حل لمدة دقيقة واحدة. ثم، شطف مع ثلاثة إلى خمسة غسل ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي حل الحجب لمدة 15 دقيقة لإزالة أي حطام. ثم، إمالة لوحة على دعم واحتضان قطرات في 500 ميكرولترات من محلول الحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. إعداد خليط الأجسام المضادة الأولية وفقا لبروتوكول النص. ثم استخدام ملعقة مستديرة ذات حواف لنقل قطرات إلى أسفل جولة 96 لوحة جيدا. احتضان قطرات في 30 ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة الأولية لكل قطرة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، نقل قطرات إلى لوحة 12 جيدا تحتوي على مليلترين من محلول الغسيل في البئر. شطف قطرات مع ثلاثة يغسل لمدة خمس دقائق. ثم، يغسل قطرات مع تسعة يغسل 30 دقيقة. في اليوم التالي ، شطف قطرات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إعداد الفلوروفور-مترافق مناسب خليط الأجسام المضادة الثانوية وفقا لبروتوكول النص. نقل قطرات إلى أسفل 96 درجة مستديرة جيدا، كما ثبت سابقا، واحتضان لوحة مع 30 ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة الثانوية لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.بعد أربع ساعات، نقل قطرات إلى لوحة 12 بئر تحتوي على مليلترين من محلول الغسيل في البئر. أولاً، شطف القطرات مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق. ثم، غسل قطرات مع أربعة يغسل لمدة 30 دقيقة. في اليوم التالي، شطف قطرات خمس مرات مع محلول الغسيل لمدة 30 دقيقة، وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. في اليوم التالي، نقل قطرات إلى أسفل جولة 96 لوحة جيدا، كما ثبت سابقا. مضاد قطرات مع وصمة عار النووية Hoechst لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل قطرات إلى لوحة 12 جيدا تحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني في البئر وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، تطبيق طبقة ضيقة من سرعة تصلب تصاعد المتوسطة على طول حواف زجاج الغطاء مربع والسماح لها لتجف لمدة دقيقة واحدة. ثم، شطف قطرة عن طريق غمس في بئر من 12 لوحة بئر تحتوي على المياه الأيونية. ونقل القطرة إلى شريحة المجهر. المقبل، الاستغناء 15 ميكرولترات من عدم تصلب المضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة على قطرات. ضع زجاج الغطاء بلطف فوق القطرة مع وسط التركيب الذي يواجه الشريحة واتركه يستقر. دع الشرائح تجف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة واخزنها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. وأخيرا، صورة الشرائح مع مجهر epifluorescence تستقيم مجهزة وظيفة قسم البصرية في 20x أو 40x الهدف. في هذا البروتوكول تم إعداد الأنسجة الليفية الوعائية وصورت. وأظهرت البيانات التمثيلية أن الثقافات السابقة PR الجسم الحي تحفز على تنبت من الـ CD-31 الحفاظ على endothelium والأوعية الدموية استجابة لـ VEGFA. وعلى العكس من ذلك، TGF