هذه الطريقة يمكن الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات ارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب والأوعية الدموية بما في ذلك دراسة الخلايا الجذعية 11c التشعب إيجابية وكيف أنها قوة دور إصابة ارتفاع ضغط الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عزل الخلايا الجذعية 11c التشعب إيجابية من الأجهزة الصلبة ودراسة دورها الفسيولوجي في مختلف الدول المرض. لذلك يمكن تطبيق هذه العملية على أنواع متعددة من الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية B، الخلايا الليمفاوية T، أحادية الخلايا، وال الضامة.
التصور لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية لفهم عزل الخلايا التشعبية ، وتحديدا عملية النقل بالتبني إلى الفئران المتلقية. للبدء، رش الصدر والجانبين من الماوس القتل الرحيم مع 70٪ الإيثانول. على الجانب الأيسر، فتح بعناية الجلد والتجويف البريتوني لفضح الطحال.
باستخدام ملقط صغيرة، بحذر نقل الأمعاء والكبد إلى الجانب الأيسر من الماوس. ثم استخدام مقص صغير لمعالجة بلطف الطحال. ضع كل طحال مُخَطَّط في أنبوب C المسمى يحتوي على ثلاثة ملليلترات من 1640 1640 من الـ RPMI.
أولا إضافة الكولاجين D وDNase لإعداد RPMI 1640 المتوسطة لإعداد حل هضم الطحال. ضع أنبوب C على المهيج شبه الآلي وتأكد من وضع الأنبوب بإحكام على الذراع الدوارة. اضغط على زر البدء على المُجنّد لتشغيل بروتوكول الطحال 04.01 لمدة 60 ثانية.
بعد ذلك، قم بفصل الأنبوب عن المُجنّد واحتضان العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في ظلّ درجة حرارة 20 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل المحلل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر بعد تصفيته من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. غسل مصفاة مع 10 ملليلتر من dPBS.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم pirate اكبر تماما وغسل بيليه عن طريق إعادة تعليق ذلك في 10 ملليلتر من dPBS. جهاز طرد مركزي تعليق في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
إعادة تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من dPBS. استخدام مقياس الهيموسيت وجرب الأزرق استبعاد لحساب عدد الخلايا. الطاردة المركزية المقبلة في 300 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا.
التعرق عظمى تماما وإعادة تعليق بيليه في 400 ملليلتر من الخلايا تنشيط مغناطيسيا الفرز العازلة. ثم إضافة 100 ملليلتر من الميكروبات CD11c لكل 100 مليون خلية. دوامة تعليق الخلية واحتضان لمدة 10 دقائق في الثلاجة في أربع درجات مئوية.
بعد ذلك، إضافة 10 ملليلترات من العازلة MACs لغسل الخلايا والطرد المركزي في 300 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استلهمت عظمى تماما وإعادة تعليق الخلايا في 500 ملليلتر من المخزن المؤقت MACs. ضع عمود LS في المجال المغناطيسي للفاصل mag ووضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحت كل عمود لجمع التدفق من خلال.
بعد ذلك ، شطف الأعمدة مع ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت. ضع تعليق الخلية على كل عمود ثم قم بتجميع التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مُلصقة. اغسل الأعمدة بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت لـ MACs واجمع الخلايا غير التي تم تصنيفها التي تمر عبرها.
اغسل أعمدة LS مرتين إضافيتين باستخدام ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت لـ MACs لكل غسل. بعد ذلك، قم بإزالة أعمدة LS من الفاصل المغناطيسي. إضافة خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت MACs إلى كل عمود ويغرق على الفور كل عمود في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر واضحة لطرد الخلايا المسمى مغناطيسيا.
استخدام مقياس الهيموسيت و Trypan استبعاد الأزرق لتحديد رقم DC CD11c إيجابية كما هو مبين في بروتوكول النص. ثم تخفيف عينة الخلية في تخفيف واحد إلى واحد في 0.4٪ Trypan حل الأزرق. أولاً، إعداد الكريات الخلية في وسائل الإعلام الثقافة DC كما هو موضح في بروتوكول النص.
Pipette 900 ميكرولترات من تعليق العاصمة في 24 شقة جيدا أسفل لوحة الصقر. إضافة 100 ميكرولترات من الملح عالية DC وسائل الإعلام ثقافة إلى كل بئر, لتركيز الصوديوم النهائي من 190 ميليمولار. ضع اللوحة في حاضنة لثاني أكسيد الكربون المرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
بعد 48 ساعة إزالة لوحة من الحاضنة. Pipette وسائل الإعلام ثقافة الخلية في بئر واحد صعودا وهبوطا لإعادة تعليق CD11c إيجابية DCs. نقل كل هذا التعليق في المقابلة وصفت 1.6 ملليلتر أنبوب.
كرر هذا لكل فرد جيدا التي كانت مطلية. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. التعرق و إعادة تعليق بيليه العاصمة مع 100 ميكرولترات من dPBS العقيمة.
بعد ذلك ، ارسم حل DC من أحد الأنابيب إلى حقنة ملليلتر واحدة ، مجهزة بإبرة نصف بوصة قياس 27. وضع السذاجة الذكور 10 أسبوع من العمر C57-أسود-6 الماوس تحت isoflurane 2٪ لتحقيق استقرار الطائرة الجراحية. تحقق من مستوى التخدير مع عدم وجود رد فعل دواسة.
بمجرد تحقيق طائرة جراحية مستقرة ، ببطء وبعناية إدخال الإبرة في الفضاء المداري الرجعية بزاوية 30 درجة تقريبًا. ببطء وسلس حقن CD11c تعليق DC إيجابية. بمجرد اكتمال الحقن ، قم بإزالة الإبرة بعناية للمساحة المدارية الرجعية ، مع التأكد من عدم تلف العين.
ثم إزالة الفئران من مخروط الأنف ومراقبتها لمدة 30 دقيقة تقريبا أثناء الانتعاش من التخدير. يظهر تحليل نموذجي لضغط الدم هنا بعد النقل بالتبني من DCs ومضخات صغيرة التناضح التي تم زرعها للجرعة المنخفضة حقن أنجيوتنسين الثاني. تجدر الإشارة إلى أن هذه الجرعة المنخفضة من أنجيوتنسين الثاني هي جرعة القامع التي لا تزيد ضغط الدم في الماوس العادي.
الفئران التي تتلقى العادي المعالج بالملح CD11c DCs إيجابية الحفاظ على ضغط الدم الطبيعي أثناء التسريب, في حين أن الفئران التي تتلقى عالية الملح المعالجة CD11c DCs إيجابية يحمل زيادة في ضغط الدم الانقباضي. ثم يتم تنفيذ تحليل تدفق قياس الخلايا باستخدام استراتيجية الغاتة هو مبين هنا لتحديد نقاء الخلايا الإيجابية CD11c معزولة. وينظر إلى زيادة إثراء الخلايا الإيجابية CD11c بالمقارنة مع الطحال الإجمالية.
وتستخدم تركيزات ميكروباتية مختلفة CD11c لاستكشاف بروتوكول الشركة المصنعة. المغناطيسي منفصلة من الطحال باستخدام 100 ميكرولتردات من ميكروبات تنتج حوالي 65٪ من الخلايا الإيجابية CD11c، في حين أن استخدام 200 ميكرولترات تسفر عن 55٪، واستخدام 300 ميكرولترس الغلة 50٪ يتم تضمين مانع FcR جنبا إلى جنب مع 100 ميكرولتردات من الميكروبات. بعد الانفصال المغناطيسي، والحصار من FcR تسفر عن ما يقرب من 65٪ CD11c الخلايا الإيجابية.
ثم يتم احتضان بعض الطحال مع 100 ميكرولترات من الميكروبات وفصلها مغناطيسيا من خلال عمود LS. يتم احتضان الخلايا المنفصلة بـ 100 ميكرولترات إضافية من CD11c ويتم فصلها مرة أخرى من خلال عمود LS. هذه العملية العزل المزدوجة أسفرت عن 92٪ خلايا إيجابية CD11c.
عند محاولة هذا الإجراء، من المهم التأكد من نقاء الخلايا المعزولة عن طريق تدفق القياسات. بعد العزل المغناطيسي للخلايا التشعبية يمكن أن تكون مُزَوَّستة لتحديد حالتها التفعيلة بواسطة التقنيات الجزيئية بما في ذلك البروتيوميات وتسلسل الخلايا المفردة. منذ تطورها ، أصبح من الممكن الآن دراسة وظيفة ودور محدد للخلايا التشعبية في ارتفاع ضغط الدم.
الباحثون الآن استكشاف مستضدات محددة في ارتفاع ضغط الدم.
