이 방법은 CD11c 양성 수지상 세포의 연구 결과 및 고혈압 상해의 역할을 어떻게 강화하는지를 포함하여 고혈압 및 심혈관 질환 분야의 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고체 기관에서 CD11c 양성 수지상 세포의 격리와 다양한 질병 상태에서의 생리적 역할의 연구입니다. 따라서 이 과정은 B 림프구, T 림프구, 단세포 및 대식세포를 포함한 다중 면역 세포 유형에 적용 될 수 있습니다.
이 기술의 시각화는 수지상 세포 격리, 특히 수용자 마우스로의 입양 전달 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 시작하려면 안락사 마우스의 가슴과 측면을 70 %에탄올로 스프레이하십시오. 왼쪽에, 조심스럽게 비장을 노출피부와 복막 구멍을 엽니 다.
작은 집게를 사용하여 창자와 간을 마우스의 왼쪽으로 조심스럽게 이동합니다. 그런 다음 작은 가위를 사용하여 비장을 부드럽게 절제합니다. 각 소비제 비장을 RPMI 1640 배지 3밀리리터가 들어 있는 라벨이 부착된 C 튜브에 넣습니다.
먼저 콜라게나아제 D와 DNase를 추가하여 RPMI 1640 배지를 준비하여 비장 소화 용액을 준비합니다. C 튜브를 반자동 균질화기에 놓고 튜브가 회전 암에 단단히 배치되도록 합니다. 균질화의 시작 버튼을 눌러 비장 04.01 프로토콜을 60초 동안 실행합니다.
그 후 균질화에서 튜브를 분리하고 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 20rpm에서 연속하여 배양합니다. 다음으로 파이펫을 사용하여 40 마이크로미터 여과기를 통해 용액을 50 밀리리터 원유형 튜브로 전송합니다. dPBS의 10 밀리리터로 여과기를 씻으세요.
세포를 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 슈퍼 나탄을 완전히 흡인하고 dPBS의 10 밀리리터에서 다시 중단하여 펠릿을 씻으십시오. 원심 분리는 300 배 g와 섭씨 4도에서 10 분 동안 서스펜션을 분리합니다.
dPBS의 5밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 혈전계와 Trypan 파란색 제외를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 다음 원심분리기는 300배, 섭씨 4도에서 10분간 세포를 펠릿합니다.
슈퍼네티를 완전히 흡인시키고 자기 활성화 된 세포 선별 버퍼의 400 밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 1억 개의 세포당 CD11c 마이크로비드 100밀리리터를 추가합니다. 셀 서스펜션을 소용돌이시키고 섭씨 4도의 냉장고에서 10분 동안 배양합니다.
그 후, 10 밀리리터의 MACs 버퍼를 추가하여 세포와 원심분리기를 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 세척합니다. 슈퍼나탈자를 완전히 흡인시키고 500밀리리터의 MACs 버퍼에서 세포를 다시 일시 중단합니다. LS 컬럼클을 매그 분리기의 자기장에 놓고 각 컬럼 아래에 15밀리리터 원원형 튜브를 배치하여 흐름을 수집합니다.
다음으로, 버퍼의 세 밀리리터와 열을 헹지. 셀 현탁액을 각 컬럼에 놓고 레이블이 없는 셀이 포함된 흐름을 수집합니다. 3밀리리터의 MACs 버퍼로 컬럼을 세척하고 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다.
세척당 3밀리리터의 MACs 버퍼를 사용하여 LS 컬럼을 2회 추가로 세척합니다. 이 후 자기 분리기에서 LS 열을 제거합니다. 각 컬럼에 5밀리리터의 MACs 버퍼를 추가하고 각 컬럼을 투명한 15 밀리리터 원판 튜브로 즉시 급락하여 자기 라벨이 부착된 세포를 플러시합니다.
혈변계 및 Trypan 파란색 제외를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 CD11c 양수 DC 번호를 결정합니다. 그런 다음 0.4%의 Trypan blue 용액에서 1 대 1 희석으로 셀 샘플을 희석시 희석합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DC 배양 매체에서 셀 펠릿을 준비합니다.
24웰 플랫 하단 팔콘 플레이트에 DC 서스펜션의 파이펫 900 마이크로 리터. 190 밀리머의 최종 나트륨 농도에 대한 각 우물에 높은 소금 DC 배양 매체의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 접시에 라벨을 부착하고 48시간 동안 섭씨 37도의 가습된 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다.
48 시간 후에 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 셀 배양 배지를 단일 웰위아래로 통해 CD11c 양성 DC를 다시 중단합니다.
도금된 각 개인에 대해 이 것을 반복합니다. 모든 튜브는 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 모든 튜브를 원심분리합니다. 100 마이크로리터의 멸균 dPBS로 수퍼를 흡인하고 DC 펠릿을 다시 중단합니다.
다음으로, 27 게이지 반인치 바늘이 장착된 튜브 중 하나에서 DC 용액을 1밀리리터 주사기로 그립니다. 순진한 남성 10 주 오래 된 C57-블랙-6 마우스 아래 2%이소플루란 을 배치 하 고 안정적인 수술 평면을 달성 하. 페달 반사의 부족으로 마취의 수준을 확인합니다.
안정적인 수술 평면이 달성되면, 천천히 조심스럽게 약 30도의 각도로 복고풍 궤도 공간에 바늘을 소개합니다. CD11c 포지티브 DC 서스펜션을 천천히 원활하게 주입합니다. 주사가 완료되면, 조심스럽게 눈을 손상시키지 않도록, 복고풍 궤도 공간에 대한 바늘을 제거합니다.
그런 다음 코 콘에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복하는 동안 약 30 분 동안 모니터링하십시오. 대표적인 혈압 분석은 낮은 용량의 안지오텐신 II 주입을 위해 이식된 DC 및 삼투성 미니 펌프의 양상 전달 에 따라 여기에 나타난다. 안지오텐신 II의 이 낮은 복용량은 정상 마우스에 있는 혈압을 증가시키지 않는 억제제 복용량이다는 것을 주의해야 합니다.
정상적인 염분 처리 CD11c 양성 DC를 받는 마우스는 주입 중에 정상적인 혈압을 유지하며, 고염 처리 CD11c 양성 DC를 받는 마우스는 수축기 혈압의 증가를 나타낸다. 유동 세포측정 분석은 상기 분리된 CD11c 양성 세포의 순도를 결정하기 위해 여기에 도시된 게이팅 전략을 활용하여 수행된다. CD11c 양성 세포의 농축이 증가하면 총 비장세포에 비해 볼 수 있습니다.
다른 CD11c 마이크로비드 농도는 제조업체의 프로토콜을 해결하는 데 활용됩니다. 마이크로비드 100 마이크로리터를 사용한 비장 세포의 자석 분리는 CD11c 양수 세포의 약 65%를 산출하며, 200마이크로리터를 사용하면 55%를 산출하고 300마이크로리터를 사용하면 50%의 FcR 차단제가 Microbeads 100 마이크로리터와 함께 포함되어 있습니다. 자기 분리 후, FcR의 봉쇄는 약 65%의 CD11c 양성 세포를 산출한다.
몇몇 비장 구체는 그 때 마이크로비드의 100 마이크로리터로 배양되고 LS 컬럼을 통해 자기로 분리됩니다. 분리된 세포는 CD11c의 추가 100 마이크로리터로 배양되고 LS 컬럼을 통해 다시 분리된다. 이 이중 격리 과정은 92%CD11c 양성 세포를 산출했습니다.
이 절차를 시도할 때, 혈류 세포측정에 의해 격리된 세포의 순도를 확인하는 것이 중요하다. 수지상 세포의 자기 격리에 따라 그들은 프로테오믹스 및 단세포 염열을 포함한 분자 기술에 의해 활성화 상태를 결정하기 위해 배양될 수 있다. 그것의 발달 부터, 그것은 지금 고혈압에 있는 수지상 세포의 기능 그리고 특정 역할을 공부하는 것이 가능합니다.
연구원은 지금 고혈압에 있는 특정 항원탐구하고 있습니다.
