Bu yöntem, CD11c pozitif dendritik hücrelerin incelenmesi ve hipertansif yaralanmanın rolünü nasıl güçlü hale getirebilirler dahil olmak üzere hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık alanlarındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı CD11c pozitif dendritik hücrelerin katı organlardan izole edilmesi ve çeşitli hastalık durumlarında fizyolojik rollerinin incelenmesidir. Yani bu süreç birden fazla bağışıklık hücresi tipleri uygulanabilir, B lenfositler de dahil olmak üzere, T lenfositler, monositler, ve makrofajlar.
Tekniğin görselleştirilmesi dendritik hücre izolasyonunu, özellikle alıcı farelere evlat edinme transfer sürecini anlamak için önemlidir. Başlamak için, göğüs ve ötanazi farenin yan% 70 etanol ile sprey. Sol tarafta, dikkatle dalak ortaya çıkarmak için deri ve periton boşluğu açın.
Küçük forceps kullanarak, dikkatli farenin sol tarafına bağırsak ve karaciğer hareket ettirin. Sonra yavaşça dalak çıkarmak için küçük makas kullanın. Her eksinti dalağını üç mililitre RPMI 1640 orta içeren etiketli bir C tüpüne yerleştirin.
İlk dalak sindirim çözeltisi hazırlamak için hazırlanan RPMI 1640 orta kollajenaz D ve DNase ekleyin. C tüpünü yarı otomatik bir homogenizer üzerine yerleştirin ve tüpün dönen kola sıkıca yerleştirildiğinden emin olun. Dalak 04.01 protokolünü 60 saniye çalıştırmak için homogenizer'ın başlangıç düğmesine basın.
Bundan sonra tüpü homogenizer'den ayırın ve numuneleri 37 derecede 20 rpm'de 15 dakika boyunca sürekli olarak kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 40 mikrometrelik bir süzgeçten filtreledikten sonra çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Süzgeci 10 mililitre dPBS ile yıkayın.
Hücreleri 300 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Daha sonra supernatant'ı tamamen aspire edin ve 10 mililitre dPBS'de yeniden askıya alarak peleti yıkayın. Süspansiyonu 300 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Hücre peletini beş mililitre dPBS'de yeniden askıya alın. Hücre sayısını saymak için hemositometre ve Trypan mavisi dışlama kullanın. Sonraki santrifüj 300 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca hücreleri pelet.
Süpernatant'ı tamamen aspire edin ve manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama tamponunun 400 mililitresinde peleti yeniden askıya alın. Sonra 100 milyon hücre başına 100 mililitre CD11c mikroboncukekleyin. Hücre süspansiyonu girdap ve dört santigrat derece bir buzdolabında 10 dakika kuluçka.
Bundan sonra, hücreleri yıkamak için 10 mililitre MACs tampon ekleyin ve santrifüj 300 kez g ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat. Süpernatant'ı tamamen aspire edin ve 500 mililitre LIK MAC tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın. LS sütunu mag ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve akışı toplamak için her sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin.
Ardından, sütunları üç mililitre arabellekle durula. Hücre süspansiyonunu her sütuna yerleştirin ve etiketlenmemiş hücreler içeren akışı toplayın. Sütunları üç mililitre MAC arabelleğiyle yıkayın ve içinden geçen etiketlenmemiş hücreleri toplayın.
Yıkama başına üç mililitre MAC tamponu kullanarak LS sütunlarını iki kez daha yıkayın. Bundan sonra, Manyetik ayırıcıdan LS sütunları çıkarın. Her sütuna beş mililitre MAC söyit arabelleği ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için her sütunu hemen 15 mililitrelik konik bir tüpe daldırın.
Metin protokolünde belirtildiği gibi CD11c pozitif DC numarasını belirlemek için hemositometre ve Trypan mavisi dışlama kullanın. Daha sonra hücre örneğini %0,4 Trypan mavi çözeltisinde bire bir seyreltme de seyreltin. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi DC kültür medyasında hücre peletlerini hazırlayın.
Pipet 900 dc süspansiyon mikrolitre 24-iyi düz alt şahin plaka içine. 190 milimolar son sodyum konsantrasyonu için, her iyi yüksek tuz DC kültür medya 100 mikrolitre ekleyin. Plakayı etiketle ve 48 saat boyunca 37 derecede nemlendirilmiş karbondioksit kuvöze yerleştirin.
48 saat sonra tabağı kuvözden çıkarın. Pipet tek bir kuyuda hücre kültürü medya cd11c pozitif DC'leri yeniden askıya almak için yukarı ve aşağı.
Kaplamalı her bir kuyu için bunu tekrarlayın. Tüm tüpleri 300 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve steril dPBS 100 mikrolitre ile DC pelet yeniden askıya.
Daha sonra, 27 gauge yarım inç iğne ile donatılmış bir mililitreşile şırınga içine tüplerin birinden DC çözeltisi çizin. Naif erkek 10 haftalık C57-siyah-6 fareyi %2 izoflurane altına yerleştirin ve istikrarlı bir cerrahi düzlem elde edin. Pedal refleks eksikliği ile anestezi düzeyini kontrol edin.
Kararlı bir cerrahi düzlem elde edildikten sonra, yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde yaklaşık 30 derecelik bir açıyla retro-orbital uzaya iğne tanıtmak. CD11c pozitif DC süspansiyonu yavaşça ve sorunsuz bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, dikkatle retro-orbital alan için iğne kaldırmak, göze zarar vermemek için emin olun.
Daha sonra fareleri burun konisinden çıkarın ve anesteziden kurtarma sırasında yaklaşık 30 dakika boyunca izleyin. Düşük doz Anjiyotensin II infüzyonu için implante edilmiş DC'lerin ve ozmotik mini pompaların benimsenen transferi sonrasında tipik bir kan basıncı analizi burada gösterilmiştir. Bu Anjiyotensin II bu düşük doz normal bir fare de kan basıncını artırmaz bir bastırıcı doz olduğu unutulmamalıdır.
Normal tuz ile tedavi edilen CD11c pozitif DC alan fareler infüzyon sırasında normal kan basıncını korurken, yüksek tuz tedavisi gören fareler CD11c pozitif DC'ler sistolik kan basıncında artış sergilerler. Akış sitometri analizi daha sonra izole CD11c pozitif hücrelerin saflığını belirlemek için burada gösterilen gating stratejisi kullanılarak gerçekleştirilir. CD11c pozitif hücrelerin toplam splenositlere göre daha fazla zenginleşmesi görülmektedir.
Üreticinin protokolünü gidermek için farklı CD11c Microbead konsantrasyonları kullanılır. 100 mikrolitre Mikroboncuk kullanarak splenositlerin manyetik ayrı cd11c pozitif hücrelerin yaklaşık% 65 verimleri, 200 mikrolitre kullanarak% 55 verimleri ve 300 mikrolitre kullanarak% 50 Bir FcR bloker ile birlikte Mikroboncuklar 100 mikrolitre dahildir. Manyetik ayrıştırma sonrasında, FcR abluka yaklaşık% 65 CD11c pozitif hücreler verir.
Bazı splenositler daha sonra 100 mikrolitre Mikroboncuk ile kuluçkaya yatırılır ve manyetik olarak bir LS sütunu ile ayrılır. Ayrılmış hücreler cd11c ek bir 100 mikrolitre ile kuluçka ve bir LS sütun ile tekrar ayrılır. Bu çift izolasyon işlemi% 92 CD11c pozitif hücreler verdi.
Bu yordamı çalışırken, akış sitometri ile izole hücrelerin saflığını onaylamak önemlidir. Dendritik hücrelerin manyetik izolasyonunu takiben proteomik ve tek hücreli dizileme gibi moleküler tekniklerle aktivasyon durumlarını belirlemek için kültürlenebilirler. Gelişiminden bu yana, artık hipertansiyonda dendritik hücrelerin işlevini ve özel rolünü incelemek mümkündür.
Araştırmacılar şimdi hipertansiyon belirli antijenler araştırıyoruz.
