Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi dell'ipertensione e delle malattie cardiovascolari, incluso lo studio delle cellule dendritiche positive CD11c e come potenziano il ruolo della lesione ipertensiva. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'isolamento delle cellule dendritiche positive CD11c dagli organi solidi e lo studio del loro ruolo fisiologico in vari stati di malattia. Quindi questo processo può essere applicato a più tipi di cellule immunitarie, inclusi linfociti B, linfociti T, monociti e macrofagi.
La visualizzazione della tecnica è fondamentale per comprendere l'isolamento delle cellule dendritiche, in particolare il processo di trasferimento adottivo nei topi riceventi. Per iniziare, spruzzare il torace e i lati del topo eutanasiato con il 70% di etanolo. Sul lato sinistro, aprire con cura la pelle e la cavità peritoneale per esporre la milza.
Usando piccole forcep, spostare cautamente l'intestino e il fegato sul lato sinistro del mouse. Quindi utilizzare piccole forbici per asportare delicatamente la milza. Mettere ogni milza asportata in un tubo C etichettato contenente tre millilitri di mezzo RPMI 1640.
Aggiungere innanzitutto la collagenasi D e la DNasi al mezzo RPMI 1640 preparato per preparare la soluzione di digestione della milza. Posizionare il tubo C su un omogeneizzatore semi-automatizzato e assicurarsi che il tubo sia strettamente posizionato sul braccio rotante. Premere il pulsante start sull'omogeneizzatore per eseguire il protocollo spleen 04.01 per 60 secondi.
Successivamente, staccare il tubo dall'omogeneizzatore e incubare i campioni a 37 gradi Celsius sotto continuo a 20 giri/min per 15 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire la soluzione in un tubo conico da 50 millilitri dopo filtrarla attraverso un filtro da 40 micrometri. Lavare il colino con 10 millilitri di dPBS.
Centrifugare le cellule a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aspirare completamente il supernatante e lavare il pellet sospendendolo in 10 millilitri di dPBS. Centrifugare la sospensione a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Sospendere di nuovo il pellet di cella in cinque millilitri di dPBS. Utilizzare un emocitometro e l'esclusione blu di Trypan per contare il numero di celle. Prossima centrifuga a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare le cellule.
Aspirare completamente il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 400 millilitri di tampone di smistamento cellulare attivato magneticamente. Quindi aggiungere 100 millilitri di microperline CD11c per 100 milioni di cellule. Vortice la sospensione cellulare e incubare per 10 minuti in frigorifero a quattro gradi Celsius.
Successivamente, aggiungere 10 millilitri di TAMPONE HC per lavare le cellule e centrifugare a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare completamente il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 500 millilitri di tampone MAC. Posizionare la colonna LS nel campo magnetico del separatore di mag e posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto ogni colonna per raccogliere il flusso attraverso.
Quindi, sciacquare le colonne con tre millilitri di tampone. Posizionare la sospensione della cella su ogni colonna e raccogliere il flusso attraverso il quale contiene celle senza etichetta. Lavare le colonne con tre millilitri di MAC buffer e raccogliere le celle senza etichetta che passano.
Lavare le colonne LS due volte in più utilizzando tre millilitri di tampone MAC per lavaggio. Successivamente, rimuovere le colonne LS dal separatore magnetico. Aggiungere cinque millilitri di buffer MAC a ogni colonna e immergere immediatamente ogni colonna in un tubo conico trasparente da 15 millilitri per sciacquare le celle etichettate magneticamente.
Utilizzare un emocitometro e l'esclusione blu di Trypan per determinare il numero CC positivo CD11c come descritto nel protocollo di testo. Quindi diluire il campione di cella con una diluizione uno a uno nella soluzione blu 0,4%Trypan. In primo luogo, preparare i pellet di cella nei supporti di coltura CC come descritto nel protocollo di testo.
Pipetta 900 microlitri della sospensione CC in piastra falcon bottom piatta da 24 pozzi. Aggiungere 100 microlitri del supporto di coltura CC ad alto sale ad ogni pozzo, per una concentrazione finale di sodio di 190 millimolare. Etichettare il piatto e posizionarlo in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Dopo 48 ore rimuovere la piastra dall'incubatore. Pipettare il supporto di coltura cellulare in un unico pozzo su e giù per sospendere di nuovo i CD11c positivi. Trasferire tutta questa sospensione in un corrispondente tubo etichettato da 1,6 millilitri.
Ripeti questo per ogni singolo pozzo che è stato placcato. Centrifuga tutti i tubi a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet DC con 100 microlitri di dPBS sterile.
Successivamente, disegnare la soluzione CC da uno dei tubi in una siringa millilitro, dotata di un ago da mezzo pollice calibro 27. Posizionare l'ingenuo topo C57-black-6 di 10 settimane di maschio sotto il 2% di isoflurane per ottenere un piano chirurgico stabile. Controllare il livello di anestesia con una mancanza di riflesso del pedale.
Una volta raggiunto un piano chirurgico stabile, introdurre lentamente e con attenzione l'ago nello spazio retro-orbitale con un angolo di circa 30 gradi. Iniettare lentamente e senza intoppi la sospensione CC positiva CD11c. Una volta completata l'iniezione, rimuovere con cura l'ago per lo spazio retro-orbitale, assicurandosi di non danneggiare l'occhio.
Quindi rimuovere i topi dal cono del naso e monitorarli per circa 30 minuti durante il recupero dall'anestesia. Una tipica analisi della pressione sanguigna è mostrata qui a seguito del trasferimento adottivo di DC e mini pompe osmotiche che sono state impiantate per infusione di Angiotensina II a bassa dose. Va notato che questa bassa dose di Angiotensina II è una dose soppressore che non aumenta la pressione sanguigna in un normale topo.
I topi che ricevono normali CD11c positivi trattati con sale mantengono una pressione sanguigna normale durante l'infusione, mentre i topi che ricevono CD11c positivi trattati con sale elevato mostrano un aumento della pressione sanguigna sistolica. L'analisi della citometria del flusso viene quindi eseguita utilizzando la strategia di gating mostrata qui per determinare la purezza delle cellule positive CD11c isolate. Si nota un maggiore arricchimento delle cellule positive del CD11c rispetto agli splenociti totali.
Diverse concentrazioni di microperline CD11c vengono utilizzate per risolvere i problemi relativi al protocollo del produttore. La separata magnetica degli splenociti che utilizzano 100 microlitri di microperline produce circa il 65% delle cellule positive cd11c, mentre l'utilizzo di 200 microlitri produce il 55% e l'utilizzo di 300 microlitri produce il 50%Un bloccante FcR è incluso insieme a 100 microlitri di microperline. A seguito della separazione magnetica, il blocco di FcR produce circa il 65%cd11c di cellule positive.
Alcuni splenociti vengono quindi incubati con 100 microlitri di microperline e separati magneticamente attraverso una colonna LS. Le cellule separate vengono incubate con altri 100 microlitri di CD11c e separate di nuovo attraverso una colonna LS. Questo doppio processo di isolamento ha prodotto celle positive CD11c al 92%.
Quando si tenta questa procedura, è importante confermare la purezza delle cellule isolate mediante citometria a flusso. Dopo l'isolamento magnetico delle cellule dendritiche possono essere coltivate per determinare il loro stato di attivazione con tecniche molecolari tra cui la proteomica e il sequenziamento a singola cellula. Dal suo sviluppo, è ora possibile studiare la funzione e il ruolo specifico delle cellule dendritiche nell'ipertensione.
I ricercatori stanno ora esplorando gli antigeni specifici nell'ipertensione.
