Diese Methode kann Schlüsselfragen in den Bereichen Bluthochdruck und Herz-Kreislauf-Erkrankungen beantworten, einschließlich der Untersuchung von CD11c positiven dendritischen Zellen und wie sie die Rolle der hypertensiven Verletzung potenzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Isolierung von CD11c-positiven dendritischen Zellen aus festen Organen und die Untersuchung ihrer physiologischen Rolle in verschiedenen Krankheitszuständen. So kann dieser Prozess auf mehrere Immunzelltypen angewendet werden, einschließlich B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen.
Die Visualisierung der Technik ist entscheidend, um die dendritische Zellisolation zu verstehen, insbesondere den Adoptivtransferprozess in Empfängermäuse. Zu Beginn die Brust und die Seiten der eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol besprühen. Auf der linken Seite, öffnen Sie vorsichtig die Haut und die Peritonealhöhle, um die Milz zu belichten.
Mit kleinen Zangen, vorsichtig bewegen Sie den Darm und die Leber auf die linke Seite der Maus. Dann verwenden Sie kleine Schere, um sanft die Milz verbrauchen. Legen Sie jede ausgeschnittene Milz in ein beschriftetes C-Rohr mit drei Millilitern RPMI 1640 Medium.
Fügen Sie zunächst Kollagennase D und DNase auf vorbereitetRPMI 1640 Medium, um die Milz-Verdauungslösung vorzubereiten. Legen Sie das C-Rohr auf einen halbautomatischen Homogenisator und stellen Sie sicher, dass das Rohr fest auf dem rotierenden Arm platziert wird. Drücken Sie die Starttaste am Homogenisator, um das Milz-Protokoll 04.01 60 Sekunden lang auszuführen.
Danach die Röhre vom Homogenisator lösen und die Proben bei 37 Grad Celsius unter durchgehend bei 20 U/min 15 Minuten bebrüten. Als Nächstes verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung in ein 50 Milliliter konisches Rohr zu übertragen, nachdem Sie sie durch ein 40-Mikrometer-Sieb gefiltert haben. Waschen Sie das Sieb mit 10 Milliliter dPBS.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann den Überstand vollständig ansaugen und das Pellet waschen, indem man es in 10 Milliliter dPBS wieder aufsetzt. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Setzen Sie das Zellpellet in fünf Milliliter n-PBS wieder auf. Verwenden Sie ein Hämozytometer und trypan blauer Ausschluss, um die Anzahl der Zellen zu zählen. Nächste Zentrifuge bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellen zu pellet.
Den Überstand vollständig ansaugen und das Pellet in 400 Millilitermagnetaktiviertem Zellsortierpuffer wieder aufhängen. Dann fügen Sie 100 Milliliter CD11c Mikroperlen pro 100 Millionen Zellen. Wirbeln Sie die Zellsuspension und inkubieren für 10 Minuten im Kühlschrank bei vier Grad Celsius.
Danach 10 Milliliter MACs Puffer hinzufügen, um die Zellen und Zentrifuge bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten zu waschen. Aspirieren Sie den Überstand vollständig und suspendieren Sie die Zellen in 500 Milliliter MACs Puffer. Legen Sie die LS-Säule in das Magnetfeld des Mag-Separators und legen Sie ein 15 Milliliter konisches Rohr unter jede Spalte, um den Durchfluss zu erfassen.
Anschließend spülen Sie die Spalten mit drei MilliliterPuffer. Platzieren Sie die Zellsuspension auf jeder Spalte, und sammeln Sie den Fluss, durch den nicht beschriftete Zellen enthalten sind. Waschen Sie die Spalten mit drei Millilitern MACs Puffer und sammeln Sie die nicht beschrifteten Zellen, die durchgehen.
Waschen Sie die LS-Säulen zwei weitere Male mit drei MilliliterN MACs Puffer pro Wäsche. Entfernen Sie danach die LS-Säulen aus dem magnetischen Trennzeichen. Fügen Sie jeder Spalte fünf Milliliter MACs-Puffer hinzu und tauchen Sie jede Säule sofort in eine klare 15-Milliliter-Konustube, um die magnetisch beschrifteten Zellen auszuspülen.
Verwenden Sie ein Hämozytometer und einen Trypan-Blauausschluss, um die im Textprotokoll beschriebene positive DC-Nummer CD11c zu bestimmen. Anschließend die Zellprobe bei einer Verdünnung in 0,4%Trypan-Blaulösung verdünnen. Bereiten Sie zunächst die Zellpellets in DC-Kulturmedien wie im Textprotokoll beschrieben vor.
Pipette 900 Mikroliter der DC-Aufhängung in 24-Well-Flachbodenfalkenplatte. Fügen Sie 100 Mikroliter der hochsalzigen DC-Kulturmedien zu jedem Brunnen hinzu, für eine endgültige Natriumkonzentration von 190 Millimolar. Beschriften Sie die Platte und legen Sie sie 48 Stunden lang in einen befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Nach 48 Stunden entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator. Pipette die Zellkultur-Medien in einem einzigen gut nach oben und unten, um die CD11c positive DCs wieder auszusetzen. Übertragen Sie all diese Suspension in einem entsprechenden beschrifteten 1,6 Milliliter Rohr.
Wiederholen Sie dies für jeden einzelnen Brunnen, der plattiert wurde. Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 300 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das DC-Pellet mit 100 Mikrolitern sterilem dPBS wieder auf.
Als nächstes ziehen Sie die DC-Lösung aus dem eines der Rohre in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Spur-Halb-Zoll-Nadel ausgestattet ist. Legen Sie die naive männliche 10 Wochen alte C57-black-6 Maus unter 2%isoflurane, um eine stabile chirurgische Ebene zu erreichen. Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie mit einem Mangel an Pedalreflex.
Sobald eine stabile Operationsebene erreicht ist, führen Sie die Nadel langsam und vorsichtig in einen Winkel von etwa 30 Grad in den retro-orbitalen Raum ein. Die CD11c positive DC-Federung wird langsam und reibungslos injiziert. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Nadel für den retro-orbitalen Raum, um sicherzustellen, dass das Auge nicht beschädigt wird.
Entfernen Sie dann die Mäuse aus dem Nasenkegel und überwachen Sie sie während der Genesung von der Anästhesie etwa 30 Minuten lang. Eine typische Blutdruckanalyse wird hier nach der Adoptivübertragung von DCs und osmotischen Minipumpen gezeigt, die für eine niedrig dosierte Angiotensin-II-Infusion implantiert wurden. Es sollte beachtet werden, dass diese niedrige Dosis von Angiotensin II eine Unterdrückerdosis ist, die den Blutdruck bei einer normalen Maus nicht erhöht.
Mäuse, die normale salzbehandelte CD11c-positive DCs erhalten, halten während der Infusion einen normalen Blutdruck aufrecht, während die Mäuse, die hochsalzbehandelte CD11c-positive DCs erhalten, einen Anstieg des systolischen Blutdrucks aufweisen. Die Strömungszytometrie-Analyse wird dann unter Verwendung der hier gezeigten Gating-Strategie durchgeführt, um die Reinheit der isolierten CD11c-positiven Zellen zu bestimmen. Eine erhöhte Anreicherung der CD11c-positiven Zellen ist im Vergleich zu den gesamten Splenozyten zu beobachten.
Verschiedene CD11c Microbead-Konzentrationen werden verwendet, um das Herstellerprotokoll zu beheben. Magnetische Trennung von Splenozyten mit 100 Mikroliter Mikroperlen ergibt etwa 65% der CD11c positiven Zellen, während die Verwendung von 200 Mikroliter ergibt 55%und mit 300 Mikroliter ergibt 50%An FcR Blocker ist zusammen mit 100 Mikroliter Mikroperlen enthalten. Nach der magnetischen Trennung ergibt die Blockade von FcR etwa 65%CD11c positive Zellen.
Einige Splenozyten werden dann mit 100 Mikroliter Mikroperlen inkubiert und magnetisch durch eine LS-Säule getrennt. Die abgetrennten Zellen werden mit weiteren 100 Mikrolitercd11c inkubiert und durch eine LS-Säule wieder getrennt. Dieser doppelte Isolationsprozess ergab 92%CD11c positive Zellen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Reinheit der isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie zu bestätigen. Nach der magnetischen Isolierung dendritischer Zellen können sie kultiviert werden, um ihren Aktivierungsstatus durch molekulare Techniken wie Proteomik und einzellige Sequenzierung zu bestimmen. Seit seiner Entwicklung ist es nun möglich, die Funktion und spezifische Rolle der dendritischen Zellen bei Bluthochdruck zu untersuchen.
Forscher erforschen nun die spezifischen Antigene bei Bluthochdruck.
