Este método pode responder a perguntas-chave nos campos da hipertensão arterial e doenças cardiovasculares, incluindo o estudo de células dendríticas positivas cd11c e como elas potencializam o papel da lesão hipertensiva. A principal vantagem dessa técnica é o isolamento de células dendríticas positivas cd11c de órgãos sólidos e o estudo de seu papel fisiológico em vários estados da doença. Assim, esse processo pode ser aplicado a vários tipos de células imunes, incluindo linfócitos B, linfócitos T, monócitos e macrófagos.
A visualização da técnica é fundamental para entender o isolamento das células dendríticas, especificamente o processo de transferência adotiva em camundongos receptores. Para começar, pulverize o peito e as laterais do rato eutanizado com 70% de etanol. No lado esquerdo, abra cuidadosamente a pele e a cavidade peritoneal para expor o baço.
Usando pequenas fórceps, mova cautelosamente os intestinos e fígado para o lado esquerdo do rato. Em seguida, use uma tesoura pequena para extirpar suavemente o baço. Coloque cada baço excisado em um tubo C rotulado contendo três mililitros de meio RPMI 1640.
Primeiro adicione colagenase D e DNase para preparar o meio RPMI 1640 para preparar a solução de digestão do baço. Coloque o tubo C sobre um homogeneizador semi-automatizado e certifique-se de que o tubo esteja bem colocado no braço rotativo. Pressione o botão de partida no homogeneizador para executar o protocolo de baço 04.01 por 60 segundos.
Depois disso, retire o tubo do homogeneizador e incubar as amostras a 37 graus Celsius em contínua a 20 rpm por 15 minutos. Em seguida, use uma pipeta para transferir a solução para um tubo cônico de 50 mililitros depois de filtrar através de um filtro de 40 micrômetros. Lave o coador com 10 mililitros de dPBS.
Centrifugar as células a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aspire completamente o supernatante e lave a pelota re-suspendendo-a em 10 mililitros de dPBS. Centrifugar a suspensão a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos.
Suspenda a cápsula de celular em cinco mililitros de dPBS. Use um hemótmetro e a exclusão azul trypan para contar o número de células. Próxima centrífuga a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar as células.
Aspire completamente o supernaente e suspenda a pelota em 400 mililitros de buffer de classificação celular ativado magneticamente. Em seguida, adicione 100 mililitros de microesferas CD11c por 100 milhões de células. Vórtice a suspensão celular e incubar por 10 minutos em uma geladeira a quatro graus Celsius.
Depois disso, adicione 10 mililitros de tampão de MACs para lavar as células e centrífugas a 300 vezes g e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Aspire completamente o supernaente e suspenda as células em 500 mililitros de buffer de MACs. Coloque a coluna LS no campo magnético do separador mag e coloque um tubo cônico de 15 mililitros sob cada coluna para coletar o fluxo através.
Em seguida, enxágue as colunas com três mililitros de tampão. Coloque a suspensão da célula em cada coluna e colete o fluxo através do qual contém células sem rótulo. Lave as colunas com três mililitros de tampão de MACs e colete as células sem rótulo que passam.
Lave as colunas LS duas vezes adicionais usando três mililitros de buffer DE MACs por lavagem. Depois disso, remova as colunas LS do separador magnético. Adicione cinco mililitros de buffer de MACs a cada coluna e mergulhe imediatamente cada coluna em um tubo cônico claro de 15 mililitros para liberar as células rotuladas magneticamente.
Use uma exclusão azul hemótmetro e trypan para determinar o número DC positivo cd11c conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, dilui a amostra celular em uma diluição de um para um em solução azul trypan de 0,4%. Primeiro, prepare as pelotas de células nos meios de cultura dc, como descrito no protocolo de texto.
Pipeta 900 microliters da suspensão DC em placa de falcão fundo plano de 24 poços. Adicione 100 microliters da alta mídia de cultura DC sal a cada poço, para uma concentração final de sódio de 190 milimôlares. Rotule a placa e coloque-a em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius por 48 horas.
Após 48 horas, retire a placa da incubadora. Pipeta a mídia de cultura celular em um único poço para cima e para baixo para suspender os DCs positivos CD11c. Transfira toda essa suspensão em um tubo correspondente rotulado de 1,6 mililitro.
Repita isso para cada poço individual que foi banhado. Centrifugar todos os tubos a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Aspire o supernascer e suspenda a pelota DC com 100 microliters de dPBS estéreis.
Em seguida, desenhe a solução DC de um dos tubos em uma seringa de um mililitro, equipada com uma agulha de meia polegada calibre 27. Coloque o ingênuo macho de 10 semanas de idade C57-black-6 mouse sob 2% de isoflurane para alcançar um plano cirúrgico estável. Verifique o nível da anestesia com a falta de reflexo do pedal.
Uma vez alcançado um plano cirúrgico estável, introduza lentamente e cuidadosamente a agulha no espaço retro-orbital em um ângulo de aproximadamente 30 graus. Injete lentamente e suavemente a suspensão DC positiva CD11c. Uma vez que a injeção esteja completa, remova cuidadosamente a agulha para o espaço retro-orbital, certificando-se de não danificar o olho.
Em seguida, remova os ratos do cone do nariz e monitore-os por aproximadamente 30 minutos durante a recuperação da anestesia. Uma análise típica da pressão arterial é mostrada aqui após a transferência adotiva de DCs e minibombas osmóticas que foram implantadas para infusão de angiotensina II de baixa dose. Deve-se notar que esta baixa dose de Angiotensin II é uma dose supressora que não aumenta a pressão arterial em um rato normal.
Camundongos que recebem DCs positivos cd11c tratados com sal normal mantêm uma pressão arterial normal durante a infusão, enquanto os camundongos que recebem DCs positivos CD11c de alto sal apresentam um aumento na pressão arterial sistólica. A análise da citometria de fluxo é então realizada utilizando a estratégia de gating mostrada aqui para determinar a pureza das células positivas cd11c isoladas. Um maior enriquecimento das células positivas CD11c é visto em comparação com o total de esplenócitos.
Diferentes concentrações de microesferas CD11c são utilizadas para solucionar problemas no protocolo do fabricante. A separação magnética de esplenócitos usando 100 microliters de Microesferas produz cerca de 65% das células positivas cd11c, enquanto o uso de 200 microliters rende 55% e o uso de 300 microliters produz 50% Um bloqueador de FcR está incluído junto com 100 microliters de Microesferas. Após a separação magnética, o bloqueio da RSC produz aproximadamente 65% de células positivas CD11c.
Alguns esplenócitos são então incubados com 100 microliters de Microesferas e separados magneticamente através de uma coluna LS. As células separadas são incubadas com mais 100 microliters de CD11c e separadas novamente através de uma coluna LS. Este processo de duplo isolamento rendeu células positivas de 92%CD11c.
Ao tentar este procedimento, é importante confirmar a pureza das células isoladas por citometria de fluxo. Após o isolamento magnético das células dendríticas, elas podem ser cultivadas para determinar seu status de ativação por técnicas moleculares, incluindo proteômica e sequenciamento unicelular. Desde o seu desenvolvimento, agora é possível estudar a função e o papel específico das células dendríticas na hipertensão.
Pesquisadores estão agora explorando os antígenos específicos na hipertensão.
