Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares, incluido el estudio de las células dendríticas positivas CD11c y cómo potencian el papel de la lesión hipertensa. La principal ventaja de esta técnica es el aislamiento de células dendríticas positivas CD11c de órganos sólidos y el estudio de su papel fisiológico en varios estados de la enfermedad. Así que este proceso se puede aplicar a múltiples tipos de células inmunitarias, incluyendo linfocitos B, linfocitos T, monocitos y macrófagos.
La visualización de la técnica es fundamental para comprender el aislamiento de células dendríticas, específicamente el proceso de transferencia adoptiva a ratones receptores. Para empezar, rocía el pecho y los lados del ratón eutanizado con 70%etanol. En el lado izquierdo, abra cuidadosamente la piel y la cavidad peritoneal para exponer el bazo.
Usando pequeños fórceps, mueva con precaución los intestinos y el hígado al lado izquierdo del ratón. Luego usa tijeras pequeñas para extirpar suavemente el bazo. Coloque cada bazo extirpado en un tubo C etiquetado que contenga tres mililitros de RPMI 1640 medio.
Primero agregue la colagenasa D y DNase al medio de RPMI 1640 preparado para preparar la solución de digestión del bazo. Coloque el tubo C en un homogeneizador semiautomático y asegúrese de que el tubo esté bien colocado en el brazo giratorio. Pulse el botón de inicio del homogeneizador para ejecutar el protocolo del bazo 04.01 durante 60 segundos.
Después de esto, separar el tubo del homogeneizador e incubar las muestras a 37 grados Celsius bajo continua a 20 rpm durante 15 minutos. A continuación, utilice una pipeta para transferir la solución a un tubo cónico de 50 mililitros después de filtrarlo a través de un colador de 40 micrómetros. Lavar el colador con 10 mililitros de dPBS.
Centrifugar las células a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante por completo y lavar el pellet volviendo a suspenderlo en 10 mililitros de dPBS. Centrifugar la suspensión a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de dPBS. Utilice un hemocitociómetro y una exclusión azul de Trypan para contar el número de celdas. Siguiente centrifugadora a 300 veces g y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar las células.
Aspirar el sobrenadante por completo y volver a suspender el pellet en 400 mililitros de búfer de clasificación de células activadas magnéticamente. Luego agregue 100 mililitros de microperlas CD11c por cada 100 millones de células. Vórtice la suspensión celular e incubar durante 10 minutos en un refrigerador a cuatro grados centígrados.
Después de esto, agregue 10 mililitros de tampones de MAC para lavar las células y centrífuga a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante por completo y volver a suspender las células en 500 mililitros de búfer de MAC. Coloque la columna LS en el campo magnético del separador de mag y coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de cada columna para recoger el flujo a través.
A continuación, enjuague las columnas con tres mililitros de tampón. Coloque la suspensión de celda en cada columna y recoja el flujo a través del cual contiene celdas sin etiquetar. Lave las columnas con tres mililitros de búfer de MAC y recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través.
Lave las columnas LS dos veces adicionales utilizando tres mililitros de tampón de MAC por lavado. Después de esto, quite las columnas LS del separador magnético. Agregue cinco mililitros de tampones de MAC a cada columna e sumerja inmediatamente cada columna en un tubo cónico claro de 15 mililitros para eliminar las células etiquetadas magnéticamente.
Utilice un hemocicómetro y una exclusión azul de Trypan para determinar el número de CC positivo CD11c como se describe en el protocolo de texto. A continuación, diluya la muestra de célula a una dilución de uno a uno en una solución azul de Trippan 0,4%. En primer lugar, prepare los pellets de celda en medios de cultivo de CC como se describe en el protocolo de texto.
Pipetear 900 microlitros de la suspensión DC en placa de halcón inferior plano de 24 pozos. Añadir 100 microlitros de los medios de cultivo de alta sal DC a cada pozo, para una concentración final de sodio de 190 mililitros. Etiquete la placa y colóquela en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados durante 48 horas.
Después de 48 horas retire la placa de la incubadora. Pipetear el medio de cultivo celular en un solo pozo hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender los DC positivos CD11c. Transfiera toda esta suspensión en un tubo correspondiente etiquetado de 1,6 mililitros.
Repita esto para cada pozo individual que fue chapado. Centrifugar todos los tubos a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de CC con 100 microlitros de dPBS estéril.
A continuación, extraiga la solución de CC de uno de los tubos en una jeringa de un mililitro, equipada con una aguja de media pulgada de calibre 27. Coloque el macho ingenuo 10 semanas de edad ratón C57-negro-6 bajo 2%isoflurano para lograr un plano quirúrgico estable. Compruebe el nivel de anestesia con una falta de reflejo de pedal.
Una vez que se logra un plano quirúrgico estable, introducir lentamente y cuidadosamente la aguja en el espacio retro-orbital en un ángulo de aproximadamente 30 grados. Inyecte lenta y suavemente la suspensión de CC positiva CD11c. Una vez completada la inyección, retire cuidadosamente la aguja para el espacio retro-orbital, asegurándose de no dañar el ojo.
Luego retire los ratones del cono nasal y vigile durante aproximadamente 30 minutos durante la recuperación de la anestesia. Un análisis típico de la presión arterial se muestra aquí después de la transferencia adoptiva de DC y minibombas osmóticas que se han implantado para la perfusión de angiotensina II de dosis baja. Cabe señalar que esta dosis baja de angiotensina II es una dosis supresora que no aumenta la presión arterial en un ratón normal.
Los ratones que reciben DC positivo CD11c normales tratados con sal mantienen una presión arterial normal durante la perfusión, mientras que los ratones que reciben DC positivo CD11c tratados con sal alta muestran un aumento en la presión arterial sistólica. A continuación, se realiza un análisis de citometría de flujo utilizando la estrategia de medición que se muestra aquí para determinar la pureza de las células positivas CD11c aisladas. Se observa un mayor enriquecimiento de las células positivas CD11c en comparación con el total de esplenocitos.
Diferentes concentraciones de microbio CD11c se utilizan para solucionar problemas del protocolo del fabricante. La separación magnética de esplenocitos que utilizan 100 microlitros de microperlas produce alrededor del 65% de las células positivas CD11c, mientras que el uso de 200 microlitros produce un 55% y el uso de 300 microlitros produce un 50%An bloqueador FcR se incluye junto con 100 microlitros de Microbeads. Después de la separación magnética, el bloqueo de FcR produce aproximadamente 65%células positivas CD11c.
Algunos esplenocitos se incuban con 100 microlitros de microperlas y se separan magnéticamente a través de una columna LS. Las células separadas se incuban con 100 microlitros adicionales de CD11c y se separan de nuevo a través de una columna LS. Este proceso de doble aislamiento produjo células positivas de 92%CD11c.
Al intentar este procedimiento, es importante confirmar la pureza de las células aisladas por citometría de flujo. Después del aislamiento magnético de las células dendríticas se pueden cultivar para determinar su estado de activación mediante técnicas moleculares, incluida la proteómica y la secuenciación de una sola célula. Desde su desarrollo, ahora es posible estudiar la función y el papel específico de las células dendríticas en la hipertensión.
Los investigadores están explorando los antígenos específicos en la hipertensión.
