Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Schwimmen-induzierte Lähmung oder SWIP zu demonstrieren, ein Verhaltenstest zur Beurteilung der Dopamin-Signalisierung bei C.elegans. SWIP ermöglicht die schnelle Identifizierung von Genen innerhalb oder im Zusammenhang mit der dopaminergen Synapsis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wirkungen, die durch einen Überschuss an extrazellulärem Dopamin erzeugt werden, das zum Beispiel durch Medikamente oder durch Mutationen am Dopamin-Transporter verursacht wird.
Um sicherzustellen, dass alle Würmer, die während des Assschwimmens getestet wurden, für die gleiche Zeit schwimmen, müssen die Tiere schnell in die Lösung übertragen werden. Demonstriert werden Sirisha Kudumala und Serene Sossi. Beide arbeiten in meinem Labor.
Um Schneckenstarterkulturen einzurichten, verwenden Sie einen sterilen Spachtel, um kleine Agarstücke von einer Platte mit gut gefütterten C.elegans zu schneiden und die Agarstücke in einzelne NA22 E.coli-Platten zu übertragen. Nach der Inkubation der Platten bei 20 Grad Celsius für drei bis vier Tage, visuell bestätigen das Vorhandensein von gravid Erwachsenen unter einem Stereomikroskop. Um eine synchronisierte Population von Würmern zu erhalten, spritzen Sie Wasser auf eine Platte voller gravid Erwachsener.
Wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um die Würmer zu lösen und verwenden Sie eine Entsorgungspipette, um die Würmer in ein 15 Milliliter Polystyrol-Konrohr zu übertragen. Nachdem Sie die Würmer von einer zweiten Platte in das Rohr gezogen haben, sammeln Sie die Würmer durch Zentrifugation für drei Wäschen in 15 Milliliter autoklaviertem Wasser pro Wäsche. Das Wasser sollte nach der letzten Wäsche klar erscheinen.
Nach der letzten Zentrifugation fünf Milliliter einer frisch zubereiteten Natriumhypochlorid-Natriumhydroxidlösung zu den Würmern geben und schnell mit einem Wirbel vermischen. Inkubieren Sie die Röhre auf einer Wippe, legen Sie einen Tropfen Wurmlösung auf ein Glasmikroskop-Dia und überprüfen Sie alle zwei Minuten unter einem Stereoskop für vier bis acht Minuten auf Wurmlyse. Wenn etwa 70% der Würmer lysiert und die Eier freigesetzt wurden, stoppen Sie sofort die Lyse mit dem Zusatz von Eipuffer.
Dann zentrifugieren Sie die Embryonen und Wurmkadaver viermal das Pellet mit frischem Eipuffer zwischen den Waschungen, um alle verbleibenden Bleichmittel zu entfernen. Nach der letzten Wäsche sollte das Pellet weiß erscheinen. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter autoklaviertem Wasser und fünf Milliliter nukzessirose, um die Embryonen durch Zentrifugation von den Kadavern zu trennen.
Entfernen Sie das Rohr nach der Dichtegradiententrennung vorsichtig aus der Zentrifuge und verwenden Sie eine Glaspasteurpipette, um drei bis vier Milliliter der am oberen Meniskus schwebenden Embryonen in ein neues 15-Milliliter-Konusrohr zu übertragen. Waschen Sie die Embryonen dreimal mit autoklaviertem Wasser, um die Saccharose zu entfernen, gefolgt von drei Wäschen im M9-Puffer. Nach der letzten Wäsche die Embryonen über Nacht auf einem Shaker in 10 Milliliter n frischer M9-Puffer brüten, damit die Eier schlüpfen und im L1-Larvenstadium bleiben.
Nach nicht mehr als 14 Stunden auf dem Shaker, waschen Sie die L1 Larven dreimal mit dem autoklavierten Wasser, um alle Pheromone zu entfernen, die von den Larven freigesetzt werden, und setzen Sie das Larvenpellet in einem Milliliter Wasser wieder auf. Verdünnen Sie ein Aliquot von Würmern auf ein Verhältnis von eins zu 10 und fügen Sie 1:10 Mikroliter Tropfen auf einem Glasschlitten hinzu und zählen Sie die Würmer unter dem Stereomikroskop. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine durchschnittliche Anzahl von Würmern zu erhalten.
Verwenden Sie eine Pipette, um genügend Tröpfchen der Wurmlösung auf eine Raumtemperatur NA22 Platte hinzuzufügen, um etwa ein mal 10 zu den dritten Würmern für die Kultur auszusäen und die Platte halb offen zu lassen, bis die Tropfen austrocknen. Dann inkubieren Sie die Platte bedeckt und kopfüber bei 20 Grad Celsius für etwa 44 bis 48 Stunden oder bis die Würmer späte L4-Stufe erreichen, wie visuell unter einem Stereomikroskop bestätigt. Zur manuellen Beurteilung von SWIP 40 Mikroliter Steuerlösung mit oder ohne 0,5 Millimolar Amphetamin in eine Glas-Spotplatte geben.
Unter einem Stereoskop acht bis zehn späte L4-Bühnenwürmer mit einem Wimpernpick chenlassen und die Pick in den Brunnen, der die Lösung enthält, untertauchen, bis sich die Würmer von der Pick entfernen und in die Lösung schwimmen. Starten Sie den Timer. Beachten Sie die Anzahl der Würmer, die in den Brunnen freigesetzt werden, und beobachten und notieren Sie die Anzahl der Würmer, die SWIP bei jeder Minutenmarke für insgesamt 10 Minuten ausstellen.
Kopieren Sie am Ende des Verfahrens die Rohdaten in eine Kalkulationstabelle und berechnen Sie den Prozentsatz der gelähmten Würmer, indem Sie die Anzahl der Würmer, die in jeder Minute gelähmt sind, durch die Gesamtzahl der Würmer dividieren, die während des Tests getestet wurden, und multiplizieren sich mit 100. Kopieren Sie die Prozentwerte in jede Grafik- und Statistiksoftware, und zeichnen Sie die Daten mit Prozentwerten von SWIP auf der y-Achse und Zeit auf der x-Achse im XY-Diagrammformat. Statistische Analysen zwischen den Kontroll- und Amphetamin-behandelten Gruppen und der Behandlungszeitpunkt können beispielsweise mittels zweiseitiger ANOVA- und Post-hoc-Analyse durchgeführt werden.
Für die automatisierte Analyse der schwimminduzierten Lähmung richten Sie die Kamera, die Wurm-Tracker-Software und das Skript ein, um die Tracking-Softwareanalyse auszuführen, und verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um einen einzelnen L4-Wurm im späten Stadium in eine Glasfleckplatte zu legen, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie dann Schwimmvideos eines Wurms nach dem anderen auf und verwenden Sie die Wurm-Tracker-Software, um die Häufigkeit von Körperbiegungen zu berechnen, nach dem Skript, das mit der Tracking-Software geliefert wurde, um die Wurm-Thrashing-Frequenz zu erhalten, und um Wärmekarten aus den Wurm-Thrashing-Daten zu generieren. Die meisten der in der Steuerungslösung getesteten Würmer schwimmen mindestens 10 Minuten ununterbrochen.
Würmer, die entweder der Kontrolle oder Amphetamin ausgesetzt sind, zeigen SWIP nicht in der ersten Minute der Beobachtung. Während würmer, die mit der Kontrolllösung behandelt werden, jedoch 10 Minuten lang schwimmen, beginnen mit Amphetamin behandelte Würmer nach zwei Minuten Behandlung SWIP auszustellen. Und nach 10 Minuten zeigen 66% der Tiere SWIP.
Hier werden Beispiele für Wärmekarten von Tieren gezeigt, die der Kontrolle oder Amphetamin ausgesetzt sind, mit einer erwarteten erheblichen Zunahme der Lähmung, die bei den mit Amphetaminen behandelten Tieren beobachtet wird. Bevor man diesen Test versucht, sollte man mit der Kommissionierung und Entwicklungsinszenierung von C.elegans gut vertraut sein. Die Beteiligung des dopaminergen Systems in das SWIP-Verhalten sollte mit Tieren ohne expression von dopaminergen Proteinen oder durch die Erschöpfung von Dopaminvesikeln mit Reserpin bestätigt werden.
SWIP kann bei der Identifizierung neuer Proteine, die am Wirkmechanismus von Medikamenten beteiligt sind, die bei der dopaminergen Synapsis wirken, eine wichtige Rolle spielen.
