L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la paralisi indotta dal nuoto o SWIP, un saggio comportamentale per valutare la segnalazione della dopamina nei C.elegans. L'SWIP consente la rapida identificazione dei geni all'interno o correlati alla sinapsi dopaminergica. Questo metodo consente l'indagine degli effetti prodotti da un eccesso di dopamina extracellulare che è causato ad esempio da farmaci o da mutazioni al trasportatore di dopamina.
Per garantire che tutti i vermi testati durante il test nuovano per la stessa quantità di tempo, gli animali devono essere trasferiti rapidamente nella soluzione. A dimostrare la procedura saranno Sirisha Kudumala e Serene Sossi. Entrambi lavorano nel mio laboratorio.
Per impostare colture di avviamento del verme, utilizzare una spatola sterile per tagliare piccoli pezzi di agar da un piatto contenente C.elegans ben nutriti e trasferire i pezzi di agar in singole piastre NA22 E.coli. Dopo aver incubato le piastre a 20 gradi Celsius per tre o quattro giorni, confermare visivamente la presenza di adulti gravidi al microscopio stereo. Per ottenere una popolazione sincronizzata di vermi, spruzzare acqua su un piatto pieno di adulti gravidi.
Ruotare delicatamente la piastra per rimuovere i vermi e utilizzare una pipetta di smaltimento per trasferire i vermi in un tubo conico in polistirolo da 15 millilitri. Dopo aver tirato i vermi da una seconda piastra nel tubo, raccogliere i vermi per centrifugazione per tre lavaggi in 15 millilitri di acqua autoclavata per lavaggio. L'acqua dovrebbe apparire limpida dopo l'ultimo lavaggio.
Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere cinque millilitri di una soluzione di idrossido di sodio ipocloruro di sodio appena preparata ai vermi e mescolare rapidamente con un vortice. Incubare il tubo su un rocker, posizionare una goccia di soluzione di verme su uno scivolo al microscopio di vetro e verificare la lisi del verme sotto uno stereoscopio ogni due minuti per quattro-otto minuti. Quando circa il 70% dei vermi è stato lisciviato e le uova erano state rilasciate, interrompere immediatamente la lisi con l'aggiunta di tampone di uova.
Quindi centrifugare gli embrioni e le carcasse di vermi quattro volte rimescolando il pellet con tampone di uova fresche tra i lavaggi per rimuovere la candeggina rimanente. Dopo l'ultimo lavaggio, il pellet dovrebbe apparire bianco. Rimescolare il pellet in cinque millilitri di acqua autoclavata e cinque millilitri di saccarosio al 60% per separare gli embrioni dalle carcasse mediante centrifugazione.
Rimuovere accuratamente il tubo dalla centrifuga dopo la separazione del gradiente di densità e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per trasferire da tre a quattro millilitri degli embrioni che galleggiano nel menisco superiore in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Lavare gli embrioni tre volte con acqua autoclavata per rimuovere il saccarosio seguito da tre lavaggi nel tampone M9. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare gli embrioni su uno shaker durante la notte in 10 millilitri di tampone M9 fresco per consentire alle uova di schiudersi e rimanere allo stadio larvale L1.
Dopo non più di 14 ore sullo shaker, lavare le larve L1 tre volte con l'acqua autoclavata per rimuovere eventuali feromoni rilasciati dalle larve e rimescolare il pellet larvale in un millilitro d'acqua. Diluire un'aliquota di vermi a un rapporto uno a 10 e aggiungere 1:10 microlitro cadere su uno scivolo di vetro e contare i vermi al microscopio stereo. Ripetere l'evento per ottenere un numero medio di worm.
Utilizzare una pipetta per aggiungere abbastanza goccioline della soluzione di verme su una piastra NA22 a temperatura ambiente per seminare circa una volta 10 al terzo verme per la coltura e lasciare la piastra semiaperta fino a quando le gocce si asciugano. Quindi incubare la piastra coperta e capovolta a 20 gradi Celsius per circa 44-48 ore o fino a quando i vermi raggiungono la fase L4 tardiva come confermato visivamente sotto un microscopio stereo. Per la valutazione manuale dell'SWIP, aggiungere 40 microlitri di soluzione di controllo con o senza anfetamina millimolare 0,5 millimolare in una piastra spot di vetro.
Sotto uno stereoscopio, scegli da otto a 10 vermi in fase L4 tardiva con un piccone per ciglia e immergere il piccone nel pozzo contenente la soluzione fino a quando i vermi non si spostano dal piccone e nuotano nella soluzione. Avviare il timer. Si noti il numero di worm rilasciati nel pozzo e si osserva e si registra il numero di worm che espongono SWIP a ogni minuto per un totale di 10 minuti.
Al termine della procedura, copiare i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcolare la percentuale di worm paralizzati dividendo il numero di worm paralizzati ad ogni minuto per il numero totale di worm testati durante il test e moltiplicandosi per 100. Copiare i valori percentuali in qualsiasi software grafico e statistico e tracciare i dati con i valori percentuali di SWIP sull'asse y e il tempo sull'asse x utilizzando il formato grafico XY. L'analisi statistica tra i gruppi di controllo e trattati con anfetamine e il tempo di trattamento può essere eseguita, ad esempio utilizzando anova bi senso e analisi post hoc.
Per l'analisi automatizzata della paralisi indotta dal nuoto, impostare la fotocamera, il software worm tracker e lo script per eseguire l'analisi del software di tracciamento e utilizzare un piccone per posizionare un singolo worm L4 in fase avanzata in una piastra spot di vetro, come mostrato in precedenza. Quindi registrare i video di nuoto di un worm alla volta e utilizzare il software worm tracker per calcolare la frequenza delle curve del corpo, seguendo lo script fornito con il software di tracciamento per ottenere la frequenza di thrashing del worm e per generare mappe di calore dai dati di thrashing del worm. La maggior parte dei vermi testati nella soluzione di controllo nuota continuamente per almeno 10 minuti.
I vermi esposti al controllo o alle anfetamine non mostrano l'SWIP nel primo minuto di osservazione. Tuttavia, mentre i vermi trattati con la soluzione di controllo continuano a nuotare per 10 minuti, i vermi trattati con anfetamina iniziano a mostrare SWIP dopo due minuti di trattamento. E dopo 10 minuti, il 66% degli animali mostra SWIP.
Qui vengono mostrati esempi di mappe di calore degli animali esposti al controllo o alle anfetamine con un previsto notevole aumento della paralisi osservata negli animali trattati con anfetamine. Prima di tentare questo saggio, si dovrebbe conoscere bene la scelta e la messa in scena dello sviluppo di C.elegans. Il coinvolgimento del sistema dopaminergico nel comportamento SWIP dovrebbe essere confermato utilizzando animali privi dell'espressione di proteine dopaminergiche o dall'esaurimento delle vescicole di dopamina con reserpina.
Swip può essere strumentale nell'identificazione di nuove proteine coinvolte nel meccanismo d'azione dei farmaci che agiscono presso la sinapsi dopaminergica.
