Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы продемонстрировать плавание индуцированной паралич или SWIP, поведенческий анализ для оценки допамина сигнализации в C.elegans. SWIP позволяет быстро идентифицировать гены внутри или связанные с дофаминергическим синапсисом. Этот метод позволяет исследование эффектов, производимых избыток внеклеточного допамина, который вызван, например, наркотики или мутации на допамина транспортера.
Для того, чтобы все черви, проверенные во время анализа плавать в течение одного и того же количества времени, животные должны быть переданы быстро в раствор. Демонстрацией процедуры будут Сириша Кудумала и Серен Сосси. Они оба работают в моей лаборатории.
Чтобы создать червь стартер культур, использовать стерильный шпатель, чтобы сократить небольшие кусочки агара из пластины, содержащей хорошо кормили C.elegans и передачи агар штук в отдельных na22 E.coli пластин. После инкубации пластин при 20 градусах по Цельсию в течение трех-четырех дней, визуально подтвердить наличие gravid взрослых под стерео микроскопом. Чтобы получить синхронизированную популяцию червей, впрыскиваете воду на тарелку, полную гравидных взрослых.
Аккуратно закружить пластину, чтобы выбить червей и использовать утилизацию пипетки для передачи червей в 15 миллилитров полистирола конической трубки. Потянув червей со второй тарелки в трубку, соберите червей путем центрифугации на три моет в 15 миллилитров автоклавной воды на стирку. Вода должна казаться чистой после последней стирки.
После последней центрифугации добавьте пять миллилитров свежеприготовленного гипохлорида натрия гидроксидного раствора червям и быстро перемешайте с вихрем. Инкубировать трубку на рокер, поместите каплю червя раствора на стеклянный микроскоп слайд и проверить на червь лиза под стереоскоп каждые две минуты в течение четырех-восьми минут. Когда около 70% червей были lysed и яйца были освобождены, немедленно остановитьлиз с добавлением буфера яйца.
Затем центрифуга эмбрионов и туш червей четыре раза resuspending гранулы со свежим буфером яйцо между моет, чтобы удалить все оставшиеся отбеливатель. После последней стирки гранулы должны казаться белыми. Повторное производство гранул в пяти миллилитров автоматической воды и пять миллилитров 60% сахарозы, чтобы отделить эмбрионы от туш центрифугации.
Удалите трубку тщательно из центрифуги после разделения градиента плотности и используйте стеклянную пипетку Pasteur для переноса трех-четырех миллилитров эмбрионов, плавающих в верхнем мениска в новую 15 миллилитровую коническую трубку. Вымойте эмбрионы три раза с автоклавной водой, чтобы удалить сахарозу, а затем три моет в буфере M9. После последней стирки инкубировать эмбрионы на шейкере на ночь в 10 миллилитров свежего буфера M9, чтобы яйца люк и остаются на стадии личинки L1.
После не более чем 14 часов на шейкере, мыть личинки L1 три раза с автоклавной водой, чтобы удалить любые феромоны, выпущенные личинками и повторно личинок гранулы в один миллилитр воды. Разбавить алицит червей к соотношению от одного до 10 и добавить 1:10 микролитер падение на стеклянную горку и рассчитывать червей под стерео микроскопом. Повторите, чтобы получить среднее количество червей.
Используйте пипетку, чтобы добавить достаточно капель раствора червя на комнатной температуре NA22 пластины семян примерно один раз 10 до третьего червей для культуры и оставить пластину наполовину открытой, пока капли высохнут. Затем инкубировать пластины покрыты и вверх дном при 20 градусах по Цельсию в течение 44 до 48 часов или до тех пор, пока черви достичь поздней стадии L4, как это подтверждено визуально под стерео микроскопом. Для ручной оценки SWIP добавьте 40 микролитров раствора управления с или без 0,5 миллимолярный амфетамин в стеклянную тарелку пятна.
Под стереоскопом, выбрать от восьми до 10 конце L4 этапе червей с ресниц забрать и погрузить забрать в хорошо содержащие раствор, пока черви сойти забрать и плавать в раствор. Запустите таймер. Обратите внимание на количество червей, выпущенных в колодец и наблюдать и записывать количество червей выставке SWIP на каждую минуту знака в общей сложности 10 минут.
В конце процедуры скопировать необработанные данные в электронную таблицу и рассчитать процент червей парализована путем деления числа червей парализована каждую минуту на общее количество червей испытания на протяжении всего анализа и умножения на 100. Копировать процентные значения в любое графинг и статистическое программное обеспечение и построения данных с процентными значениями SWIP на оси и времени на x-оси с помощью формата графика XY. Статистический анализ среди контрольных и амфетамин-обработанных групп и времени лечения может быть выполнен, например, с помощью двухпутного ANOVA и пост-специального анализа.
Для автоматизированного анализа паралича, вызванного плаванием, установите камеру, программное обеспечение для отслеживания червей и скрипт для запуска анализа программного обеспечения отслеживания и использования выбора ресниц для поместить одного червя поздней стадии L4 в стеклянную пластину пятна, как показано ранее. Затем записывают плавательные видео одного червя за один раз и используют программное обеспечение трекера червя для расчета частоты изгибов тела, следуя сценарию, предоставленную программным обеспечением для отслеживания для получения частоты обмолота червя, и для создания тепловых карт из данных обмолота червя. Большинство червей, протестированных в растворе управления, плавают непрерывно в течение по крайней мере 10 минут.
Черви подвергаются либо контроля или амфетамина не показывают SWIP в первую минуту наблюдения. Однако, в то время как черви, обработанные раствором контроля продолжают плавать в течение 10 минут, черви, обработанные амфетамином, начинают проявлять SWIP после двух минут лечения. И через 10 минут, 66% животных показывают SWIP.
Здесь приведены примеры тепловых карт животных, подвергшихся воздействию контроля или амфетамина, с ожидаемым значительным увеличением паралича, наблюдаемого у животных, обработанных амфетамином. Прежде чем пытаться этот анализ, следует быть хорошо знакомы с сбором и развития постановки C.elegans. Участие дофаминергической системы в поведении SWIP должно быть подтверждено с помощью животных, не имеющих выражения дофаминергических белков или истощения дофаминовых пузырьков с Reserpine.
SWIP может играть важную роль в выявлении новых белков, участвующих в механизме действия препаратов, действующих при дофаминергическом синапсисе.
