המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שחייה-Induced שיתוק או SWIP, הערכה התנהגותית כדי להעריך דופמין איתות C.elegans. SWIP מאפשר זיהוי מהיר של גנים בתוך או קשור סינפסת דופאמין. שיטה זו מאפשרת את חקירת ההשפעות המיוצרות על ידי עודף של דופמין חוץ תאית הנגרמת למשל על ידי תרופות או על ידי מוטציות על טרנספורטר דופמין.
כדי להבטיח שכל התולעים שנבדקו במהלך המבחן ישחו במשך אותה כמות זמן, יש להעביר את בעלי החיים במהירות לפתרון. הדגימה של ההליך תהיה סירישה קודומאלה ושלווה סוסי. שניהם עובדים במעבדה שלי.
כדי להקים תרבויות סטרטר תולעת, להשתמש מרית סטרילית לחתוך חתיכות קטנות של אגר מצלחת המכילה C.elegans מוזן היטב ולהעביר את חתיכות אגר לתוך צלחות NA22 E.coli בודדים. לאחר הדגירה של הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, חזותית לאשר את נוכחותם של מבוגרים gravid תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי להשיג אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים, להשפריץ מים על צלחת מלאה מבוגרים gravid.
בעדינות מערבל את הצלחת כדי לנתק את התולעים ולהשתמש פיפטה סילוק להעביר את התולעים לתוך צינור חרוט פוליסטירן 15 מיליליטר. לאחר משיכת התולעים מצלחת שנייה לתוך הצינור, לאסוף את התולעים על ידי צנטריפוגה במשך שלוש שטיפות ב 15 מיליליטר של מים autoclaved לכל לשטוף. המים צריכים להיראות צלולים לאחר הכביסה האחרונה.
לאחר הצנטריפוגה האחרונה, מוסיפים חמישה מיליליטר של פתרון נתרן hypochloride הידרוקסידי טרי לתולעים ומערבבים במהירות עם מערבולת. להדק את הצינור על נדנדה, למקם טיפה של פתרון תולעת על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית ולבדוק תות תולעת תחת סטריאוסקופ כל שתי דקות במשך ארבע עד שמונה דקות. כאשר כ-70% מהתולעים שוחררו והביצים שוחררו, עצרו מיד את התיזה עם תוספת של חיץ ביצים.
ואז צנטריפוגה העוברים פגרי תולעת ארבע פעמים resuspending את גלולה עם חיץ ביצה טרי בין שוטף כדי להסיר את כל אקונומיקה שנותרה. לאחר הכביסה האחרונה, גלולה צריך להיראות לבן. תבזבזו מחדש את גלולת המים בחמישה מיליליטר של מים אוטוקלאבים וחמישה מיליליטר של 60% סוכרוז כדי להפריד את העוברים מהגסים באמצעות צנטריפוגה.
הסר את הצינור בזהירות מן הצנטריפוגה לאחר הפרדת שיפוע צפיפות ולהשתמש פיפטה פסטר זכוכית להעביר שלושה עד ארבעה מיליליטר של העוברים צפים במניסקוס העליון לתוך צינור חרוט חדש 15 מיליליטר. לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם מים autoclaved כדי להסיר את סוכרוז ואחריו שלוש שטיפות במאגר M9. לאחר הכביסה האחרונה, דגירה העוברים על שייקר לילה ב 10 מיליליטר של חיץ M9 טרי כדי לאפשר את הביצים לבקוע ולהישאר בשלב זחל L1.
לאחר לא יותר מ 14 שעות על שייקר, לשטוף את הזחלים L1 שלוש פעמים עם מים autoclaved כדי להסיר את כל פרומונים שפורסמו על ידי הזחלים ולתלות מחדש את גלולת הזחל במיליליטר אחד של מים. לדלל aliquot של תולעים ליחס של אחד עד 10 ולהוסיף 1:10 טיפת microliter על מגלשת זכוכית לספור את התולעים תחת מיקרוסקופ סטריאו. חזור על הפעולה כדי להשיג מספר ממוצע של תולעים.
השתמש פיפטה להוסיף טיפות מספיק של פתרון התולעת על צלחת NA22 טמפרטורת החדר לזרוע בערך פעם אחת 10 לתולעים השלישית לתרבות ולהשאיר את הצלחת חצי פתוח עד טיפות להתייבש. לאחר מכן הדגירה את הצלחת מכוסה במהופך ב 20 מעלות צלזיוס במשך כ 44 עד 48 שעות או עד התולעים להגיע בשלב L4 מאוחר כפי שאושר חזותית תחת מיקרוסקופ סטריאו. להערכה ידנית של SWIP, להוסיף 40 microliters של פתרון שליטה עם או בלי אמפטמין 0.5 מילימולר לתוך צלחת ספוט זכוכית.
תחת סטריאוסקופ, בחר 8 עד 10 תולעי שלב L4 מאוחרות עם פיק עפעף והשקע את הבחירה באר המכילה את הפתרון עד שהתולעים יזוזו מהבחירה וישחו לתוך הפתרון. הפעל את שעון הזמן. שים לב למספר התולעים ששוחררו לתוך הבאר ולהתבונן ולתזמן את מספר התולעים המציגות SWIP בכל סימן דקה במשך סך של 10 דקות.
בסוף ההליך, להעתיק את הנתונים הגולמיים לתוך גיליון אלקטרוני ולחשב את אחוז התולעים משותק על ידי חלוקת מספר התולעים משותק בכל דקה על ידי המספר הכולל של תולעים שנבדקו לאורך הבדיקה והתרבות על ידי 100. העתק את ערכי האחוזים לכל גרפים ותוכנות סטטיסטיות והתווה את הנתונים עם ערכי אחוזים של SWIP בציר ה- y ובשעה בציר ה- x באמצעות תבנית הגרף XY. ניתוח סטטיסטי בקרב קבוצות הבקרה והאמפטמין וזמן הטיפול ניתן לבצע, למשל באמצעות ניתוח דו-כיווןי של ANOVA ופוסט הוק.
לניתוח אוטומטי של שיתוק הנגרמת על ידי שחייה, הגדר את המצלמה, תוכנת מעקב התולעת והתסריט כדי להריץ את ניתוח תוכנת המעקב ולהשתמש בבחירה של עפעפיים כדי למקם תולעת L4 אחת בשלב מאוחר לתוך צלחת ספוט זכוכית כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן להקליט קטעי וידאו שחייה של תולעת אחת בכל פעם ולהשתמש בתוכנת גשש תולעת כדי לחשב את התדירות של עיקולי הגוף, בעקבות התסריט שסופק עם תוכנת המעקב כדי להשיג את תדירות תדירות התותחים תולעת, וליצור מפות חום מן הנתונים תכריעת התולעת. רוב התולעים שנבדקו בתסרון הבקרה שוחות ברציפות במשך 10 דקות לפחות.
תולעים שנחשפו לשליטה או אמפטמין אינן מראות SWIP בדקה הראשונה של התצפית. עם זאת, בעוד תולעים שטופלו בתתופת הבקרה ממשיכות לשחות במשך 10 דקות, תולעים שטופלו באמפטמין מתחילות להפגין SWIP לאחר שתי דקות של טיפול. ואחרי 10 דקות, 66% מבעלי החיים מראים SWIP.
כאן מוצגות דוגמאות למפות חום של בעלי חיים שנחשפו לשליטה או לאמפטמין עם עלייה ניכרת צפויה בשיתוק שנצפה בבעלי החיים שטופלו באמפטמין. לפני שתנסה את ההתמדה הזו, יש להכיר היטב את הבימוי ההתפתחותי של C.elegans. המעורבות של מערכת דופאמין בהתנהגות SWIP צריך להיות מאושר באמצעות בעלי חיים חסרים את הביטוי של חלבונים דופאמין או על ידי דלדול של וריונים דופמין עם Reserpine.
SWIP יכול להיות אינסטרומנטלי בזיהוי חלבונים חדשים המעורבים במנגנון הפעולה של תרופות הפועלות בסינאפסיס הדופאמינרגית.
