この手順の全体的な目標は、水泳誘発麻痺またはSWIP、C.elegansのドーパミンシグナル伝達を評価するための行動アッセイを実証することです。SWIPは、内またはドーパミン作動性シナプスに関連する遺伝子の迅速な同定を可能にする。この方法は、薬物またはドーパミン輸送体での突然変異によって引き起こされる過剰の細胞外ドーパミンによって生じる効果の調査を可能にする。
アッセイ中にテストされたすべてのワームが同じ時間泳ぐようにするには、動物を迅速に溶液に移す必要があります。手順を実証するシリシャ・クドゥマラとセリーヌ・ソッシです。彼らは二人とも私の研究室で働いています。
ワームスターター培養を設定するには、滅菌ヘラを使用して、よく供給されたC.elegansを含むプレートから寒天の小片を切断し、寒天片を個々のNA22大腸菌プレートに移します。20°Cでプレートを3〜4日間インキュベートした後、ステレオ顕微鏡下でグラビド大人の存在を視覚的に確認する。ワームの同期された集団を得るために、グラビッド大人でいっぱいのプレートに水を噴出する。
プレートをそっと旋回してワームを取り除き、処分ピペットを使用してワームを15ミリリットルのポリスチレン円錐管に移します。第2のプレートからチューブにワームを引っ張った後、洗浄ごとに15ミリリットルのオートクレーブ水で3回の洗浄のために遠心分離によってワームを収集します。水は最後の洗浄後に透明に見えるはずです。
最後の遠心分離の後、作りたての亜塩素酸ナトリウム水酸化ナトリウム溶液を5ミリリットル加えて、ボルテックスと急速に混合します。ロッカーにチューブをインキュベートし、ガラス顕微鏡スライドにワーム溶液を一滴置き、2分ごとに4〜8分間ステレオスコープの下でワーム溶解がないか確認します。約70%の虫が固まり卵が放出されると、すぐに卵バッファーを加えてライシスを停止します。
その後、胚とワームの死体を遠心分離し、残りの漂白剤を除去するために、洗剤の間に新鮮な卵バッファーでペレットを再懸濁します。最後の洗浄後、ペレットは白く表示されます。ペレットを5ミリリットルのオートクレーブ水と60%スクロースの5ミリリットルで再懸濁し、遠心分離によって胚を死体から分離する。
密度勾配分離後に遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、ガラスパスツールピペットを使用して、上部半月板に浮かぶ胚の3〜4ミリリットルを新しい15ミリリットルの円錐形チューブに移します。胚をオートクレーブ水で3回洗浄し、ショ糖を取り除き、続いてM9バッファーに3回洗浄します。最後の洗浄の後、卵が孵化し、L1幼虫段階にとどまることを可能にするために、新鮮なM9バッファーの10ミリリットルで一晩シェーカーに胚をインキュベートします。
シェーカーで14時間を過ぎなかった後、L1幼虫をオートクレーブ水で3回洗い、幼虫が放出するフェロモンを取り除き、幼虫ペレットを1ミリリットルの水で再懸濁させます。ワームのアリコートを1〜10の比率に希釈し、ガラススライドに1:10マイクロリットルの落下を加え、ステレオ顕微鏡の下でワームを数えます。ワームの平均数を取得する場合は、この手順を繰り返します。
ピペットを使用して、ワーム溶液の十分な液滴を室温NA22プレートに加え、培養のために3番目のワームに約10回播種し、滴が乾燥するまでプレートを半分開いたままにしておきます。その後、プレートを覆い、20°Cで約44〜48時間、またはステレオ顕微鏡で視覚的に確認されたように、ワームがL4後期に達するまでインキュベートします。SWIPの手動評価のために、ガラススポットプレートに0.5ミリモルアンフェタミンの有無にかかわらず40マイクロリットルの制御溶液を加える。
ステレオスコープの下で、まつげピックで8〜10後期L4ステージワームを選び、ワームがピックから離れて溶液に泳ぐまで、溶液を含む井戸にピックを沈めます。タイマーを開始します。井戸に放出されたワームの数を記録し、SWIPを示すワームの数を1分ごとに観察し、合計10分間記録します。
手順の最後に、生データをスプレッドシートにコピーし、1分間に麻痺したワームの数をアッセイ全体でテストしたワームの総数で割り、100を掛けることで麻痺したワームの割合を計算します。パーセント値を任意のグラフおよび統計ソフトウェアにコピーし、XY グラフ形式を使用して Y 軸に SWIP のパーセント値を、X 軸に時間をプロットします。対照およびアンフェタミン処理群の統計分析と治療時間は、例えば双方向のANOVAおよびポストホック分析を用いて行うことができる。
水泳による麻痺の自動分析のために、カメラ、ワームトラッカーソフトウェア、スクリプトを設定してトラッキングソフトウェア分析を実行し、まつげピックを使用して、前述のように単一の後期L4ワームをガラススポットプレートに配置します。次に、一度に1つのワームの水泳ビデオを記録し、ワームトラッカーソフトウェアを使用してボディベンドの頻度を計算し、追跡ソフトウェアに付属するスクリプトに従ってワームスラッシング周波数を取得し、ワームスラッシングデータからヒートマップを生成します。制御ソリューションでテストされたワームのほとんどは、少なくとも10分間連続して泳ぎます。
コントロールまたはアンフェタミンのいずれかに曝露されたワームは、観察の最初の分でSWIPを示さない。しかし、対照溶液で処理されたワームは10分間泳ぎ続けるが、アンフェタミンで処理されたワームは2分間の治療の後にSWIPを示し始める。そして10分後、動物の66%がSWIPを示す。
ここで、コントロールまたはアンフェタミンに曝露された動物のヒートマップの例は、アンフェタミン処理動物において観察される麻痺のかなりの増加を示している。このアッセイを試みる前に、C.elegansのピッキングと発達ステージングをよく知っているはずです。SWIP挙動におけるドーパミン作動系の関与は、ドーパミン作動性タンパク質の発現を欠く動物を用いて、またはレセルピンを用いたドーパミン小胞の枯渇によって確認されるべきである。
SWIPは、ドーパミン作動性シナプスに作用する薬物の作用機序に関与する新しいタンパク質の同定に役立つ可能性がある。
