游泳诱导麻痹对线虫多巴胺信号的评价

此程序的总体目标是演示游泳诱发麻痹或 SWIP，这是一种行为分析，用于评估 C.elegans 中的多巴胺信号。SWIP 允许快速识别多巴胺突触内或相关的基因。此方法允许调查过量的细胞外多巴胺产生的影响，例如由药物或多巴胺运输器的突变引起。

为了确保在检测期间测试的所有蠕虫在相同时间进行，动物必须迅速转移到溶液中。展示程序将是西里沙·库杜马拉和塞琳·索西。他们都在我的实验室工作。

要建立蠕虫启动培养物，请使用无菌铲从含有良好喂养的 C.elegans 的盘子中切出小块的阿加，然后将汞片转移到单独的 NA22 大肠杆菌板中。在20摄氏度下孵育3至4天后，在立体显微镜下直观地确认有格拉维德成人的存在。为了获得同步的蠕虫种群，将水喷到装满成年的盘子里。

轻轻旋转板以将蠕虫移出，并使用处置移液器将蠕虫转移到 15 毫升聚苯乙烯锥形管中。将蠕虫从第二个盘子拉入管中后，通过离心收集蠕虫，每次洗涤 15 毫升的自洗水中进行三次洗涤。上次洗净后，水应该会显得清澈。

最后离心后，在蠕虫中加入五毫升新鲜准备好的次氯钠氢氧化钠溶液，并迅速与漩涡混合。在摇杆上孵育管子，将一滴蠕虫溶液放在玻璃显微镜幻灯片上，并在立体镜下检查蠕虫解，每两分钟四到八分钟。当大约70%的蠕虫被解化，卵子被释放，立即停止与鸡蛋缓冲的解解。

然后将胚胎和蠕虫尸体离心四次，用新鲜鸡蛋缓冲液在洗涤之间重新填充颗粒，以去除剩余的漂白剂。上次洗涤后，颗粒应显示为白色。将颗粒重新用五毫升的自功能化水和五毫升的60%蔗糖中重新供应，通过离心将胚胎与尸体分离。

在密度梯度分离后小心地从离心机取出管子，并使用玻璃巴斯德移液器将漂浮在上半月板的三到四毫升胚胎转移到新的 15 毫升锥形管中。用自洗水清洗胚胎三次，取出蔗糖，然后用M9缓冲液洗三次。最后一次洗涤后，在10毫升的新鲜M9缓冲液中孵育胚胎过夜，让卵子孵化并留在L1幼虫阶段。

在摇床上不超过14小时后，用自洗水清洗L1幼虫三次，以去除幼虫释放的任何信息素，并在一毫升水中重新暂停幼虫颗粒。将蠕虫的等分稀释为 1 到 10 的比例，并将 1:10 微升滴到玻璃幻灯片上，并在立体显微镜下数出蠕虫。重复重复，以获得平均数量的蠕虫。

使用移液器将足够的蠕虫溶液液滴添加到室温 NA22 板上，将大约 10 倍种子种子到培养的第三个蠕虫中，使板半开，直到滴干。然后在20摄氏度下将覆盖和倒置的板孵育约44至48小时，或直到蠕虫在立体显微镜下通过视觉方式确认的L4晚期。对于 SWIP 的手动评估，在玻璃现货板中加入 40 微升控制溶液，带或不带 0.5 毫摩尔安非他明。

在立体示波器下，用睫毛拾取 8 到 10 个后期 L4 阶段蠕虫，将拾取器淹没在包含溶液的井中，直到蠕虫离开拾取并游入溶液中。启动计时器。注意释放到井中释放的蠕虫数量，并观察和记录显示 SWIP 的蠕虫数量，每分钟标记一次，总共 10 分钟。

在过程结束时，将原始数据复制到电子表格中，通过将每分钟瘫痪的蠕虫数量除以在整个检测过程中测试的蠕虫总数除以 100 来计算瘫痪的蠕虫百分比。将百分比值复制到任何图形和统计软件中，并使用 XY 图形格式在 y 轴上绘制具有 SWIP 百分比的数据和 x 轴上的时间。可对控制和安非他明治疗组的统计分析以及治疗时间进行，例如使用双向的 ANOVA 和后期分析。

对于游泳诱发的瘫痪的自动分析，请设置摄像头、蠕虫跟踪器软件和脚本来运行跟踪软件分析，并使用睫毛拾取将单个后期 L4 蠕虫放入玻璃点板中，如前面所示。然后一次录制一个蠕虫的游泳视频，并使用蠕虫跟踪器软件计算身体弯曲的频率，按照提供的脚本与跟踪软件获取蠕虫鞭打频率，并生成来自蠕虫冲击数据的热图。在控制解决方案中测试的大多数蠕虫连续游至少 10 分钟。

暴露在控制或安非他明的蠕虫在观察的第一分钟不显示 SWIP。然而，当使用控制溶液治疗的蠕虫继续游10分钟时，用安非他明治疗的蠕虫在经过两分钟的治疗后开始表现出SWIP。10分钟后，66%的动物显示SWIP。

这里显示了接触控制物或安非他明的动物的热图示例，预计安非他明处理动物的瘫痪率将显著增加。在尝试这种检测之前，人们应该非常熟悉C.elegans的采摘和发展阶段。多巴胺系统在SWIP行为中的参与，应使用缺乏多巴胺蛋白表达的动物或多巴胺囊泡与雷瑟平的耗竭来确认。

SWIP可以帮助识别参与多巴胺突触药物作用机制的新蛋白质。