O objetivo geral deste procedimento é demonstrar paralisia induzida pela natação ou SWIP, um ensaio comportamental para avaliar a sinalização de dopamina em C.elegans. O SWIP permite a identificação rápida de genes dentro ou relacionados à sinapse dopaminérgica. Este método permite a investigação dos efeitos produzidos por um excesso de dopamina extracelular que é causada, por exemplo, por drogas ou por mutações no transportador de dopamina.
Para garantir que todos os vermes testados durante o ensaio nadassem pela mesma quantidade de tempo, os animais devem ser transferidos rapidamente para a solução. Demonstrando o procedimento serão Sirisha Kudumala e Serene Sossi. Ambos trabalham no meu laboratório.
Para configurar culturas de partida de vermes, use uma espátula estéril para cortar pequenos pedaços de ágar de uma placa contendo C.elegans bem alimentados e transferir as peças de ágar em placas individuais NA22 E.coli. Depois de incubar as placas a 20 graus Celsius por três a quatro dias, confirme visualmente a presença de adultos gravid sob um microscópio estéreo. Para obter uma população sincronizada de vermes, esguiche água em um prato cheio de adultos gravid.
Gire suavemente a placa para desalojar os vermes e use uma pipeta de disposição para transferir os vermes para um tubo cônico de poliestireno de 15 mililitros. Depois de puxar os vermes de uma segunda placa para o tubo, colete os vermes por centrifugação para três lavagens em 15 mililitros de água autoclavada por lavagem. A água deve parecer limpa após a última lavagem.
Após a última centrifugação, adicione cinco mililitros de uma solução de hidróxido de sódio recém-preparada para os vermes e misture rapidamente com um vórtice. Incubar o tubo em um roqueiro, coloque uma gota de solução de verme em um slide de microscópio de vidro e verifique se há lise de verme sob um estereoscópio a cada dois minutos por quatro a oito minutos. Quando cerca de 70% dos vermes foram liseados e os ovos foram liberados, pare imediatamente a lise com a adição de tampão de ovos.
Em seguida, centrifugar os embriões e carcaças de vermes quatro vezes resusususe a pelota com tampão de ovo fresco entre as lavagens para remover qualquer alvejante restante. Após a última lavagem, a pelota deve parecer branca. Resuspenque a pelota em cinco mililitros de água autoclavada e cinco mililitros de 60% de sacarose para separar os embriões das carcaças por centrifugação.
Remova o tubo cuidadosamente da centrífuga após a separação do gradiente de densidade e use uma pipeta pasteur de vidro para transferir de três a quatro mililitros dos embriões flutuando no menisco superior em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Lave os embriões três vezes com água autoclavada para remover a sacarose seguida de três lavagens no tampão M9. Após a última lavagem, incubar os embriões em um shaker durante a noite em 10 mililitros de tampão M9 fresco para permitir que os ovos eclodam e permaneçam no estágio larval L1.
Depois de não mais do que 14 horas no agitador, lave as larvas L1 três vezes com a água autoclavada para remover quaisquer feromônios liberados pelas larvas e resuspenque a pelota larval em um mililitro de água. Diluir uma alíquota de vermes para uma proporção de um a 10 e adicionar 1:10 microliter cair em um slide de vidro e contar os vermes sob o microscópio estéreo. Repita para obter um número médio de vermes.
Use uma pipeta para adicionar gotículas suficientes da solução de vermes em uma placa NA22 de temperatura ambiente para semear aproximadamente uma vez 10 para o terceiro verme para a cultura e deixar a placa meio aberta até que as gotas sequem. Em seguida, incubar a placa coberta e de cabeça para baixo a 20 graus Celsius por cerca de 44 a 48 horas ou até que os vermes cheguem ao estágio L4 tardio, como confirmado visualmente sob um microscópio estéreo. Para avaliação manual do SWIP, adicione 40 microliters de solução de controle com ou sem anfetamina de 0,5 mililitro em uma placa de vidro.
Sob um estereóscópio, escolha de oito a 10 vermes de estágio L4 tardios com uma picareta de cílios e submerse a picareta no poço contendo a solução até que os vermes se movam para fora da picareta e nadem para a solução. Inicie o temporizador. Observe o número de vermes lançados no poço e observe e regise o número de vermes exibindo SWIP em cada minuto marca por um total de 10 minutos.
No final do procedimento, copie os dados brutos em uma planilha e calcule a porcentagem de vermes paralisados dividindo o número de vermes paralisados a cada minuto pelo número total de vermes testados ao longo do ensaio e multiplicando por 100. Copie os valores por cento em qualquer software gráfico e estatístico e plote os dados com valores percentual de SWIP no eixo y e tempo no eixo x usando o formato gráfico XY. A análise estatística entre os grupos de controle e tratamento de anfetamina e o tempo de tratamento podem ser realizadas, por exemplo, utilizando-se análises bidirecionais de ANOVA e pós-hoc.
Para análise automatizada da paralisia induzida pela natação, configure a câmera, o software worm tracker e o script para executar a análise do software de rastreamento e use uma picareta de cílios para colocar um único worm L4 em um local de vidro, como mostrado anteriormente. Em seguida, grave vídeos de natação de um worm de cada vez e use o software worm tracker para calcular a frequência de dobras corporais, seguindo o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de desbaste de worm, e para gerar mapas de calor a partir dos dados de espancamento de worms. A maioria dos vermes testados na solução de controle nadam continuamente por pelo menos 10 minutos.
Vermes expostos ao controle ou à anfetamina não mostram SWIP no primeiro minuto de observação. No entanto, enquanto os vermes tratados com a solução de controle continuam nadando por 10 minutos, os vermes tratados com anfetamina começam a exibir SWIP após dois minutos de tratamento. E depois de 10 minutos, 66% dos animais mostram SWIP.
Aqui exemplos de mapas de calor de animais expostos ao controle ou à anfetamina são mostrados com um aumento considerável esperado na paralisia observada nos animais tratados com anfetamina. Antes de tentar este ensaio, deve-se estar bem familiarizado com a colheita e desenvolvimento de C.elegans. O envolvimento do sistema dopaminérgico no comportamento swip deve ser confirmado utilizando-se animais sem a expressão de proteínas dopaminérgicas ou pelo esgotamento de vesículas de dopamina com Reserpine.
O SWIP pode ser fundamental na identificação de novas proteínas envolvidas no mecanismo de ação de medicamentos que atuam na sinápsia dopaminérgica.
