이 절차의 전반적인 목표는 수영 유도 마비 또는 SWIP를 입증 하는, C.elegans에서 도파민 신호를 평가 하는 행동 분석. SWIP는 도파민성 시냅시스 내 또는 관련 유전자의 신속한 식별을 허용합니다. 이 방법은 약물이나 도파민 수송기의 돌연변이에 의해 예를 들어 발생하는 세포 외 도파민의 과잉에 의해 생성 된 효과의 조사를 할 수 있습니다.
분석 중에 테스트된 모든 웜이 동일한 시간 동안 수영할 수 있도록 동물은 신속하게 용액으로 이송되어야 합니다. 시리샤 쿠두말라와 고요한 소시입니다. 그들은 모두 내 실험실에서 작동합니다.
웜 스타터 문화를 설정하려면 멸균 주걱을 사용하여 C.elegans를 잘 먹이는 접시에서 작은 한천 조각을 자르고 한천 조각을 개별 NA22 E.coli 플레이트로 옮길 수 있습니다. 3~4일 동안 섭씨 20도에서 플레이트를 배양한 후 스테레오 현미경으로 중력 성인의 존재를 시각적으로 확인합니다. 벌레의 동기화 된 인구를 얻으려면, 중력 성인의 전체 접시에 물을 분출.
부드럽게 웜을 빼내기 위해 접시를 소용돌이게 하고 폐기 파이펫을 사용하여 벌레를 15 밀리리터 폴리스티렌 원내 튜브로 옮춥시다. 두 번째 플레이트에서 벌레를 튜브로 끌어낸 후, 세척당 15밀리리터의 자동 세척기에서 3개의 세척을 위해 원심분리로 벌레를 수집합니다. 물은 마지막 세척 후 맑게 나타납니다.
마지막 원심분리 후, 새로 준비된 저혈당 나트륨 용액 5밀리리터를 웜에 넣고 소용돌이와 빠르게 섞는다. 로커에 튜브를 배양하고, 유리 현미경 슬라이드에 벌레 용액 한 방울을 놓고 4~8분 동안 2분마다 입체 범위 아래에 웜 용액을 검사합니다. 벌레의 약 70%가 lysed되고 계란이 방출되었을 때, 계란 버퍼를 추가하여 즉시 리시스를 중지하십시오.
그런 다음 배아와 벌레 시체를 4번 재중단하여 남은 표백제를 제거합니다. 마지막 세척 후 펠릿은 흰색으로 표시되어야 합니다. 유리색 물 5밀리리터와 60%의 자당 5마리의 밀리리터에서 펠릿을 재연하여 배아를 원심분리로 시체로부터 분리한다.
밀도 그라데이션 분리 후 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상반신 연반상에 떠있는 배아의 3~4밀리리터를 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮킨다. 자당을 제거하기 위해 오토클레이브 물로 배아를 세 번 씻은 다음 M9 완충제에서 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 신선한 M9 버퍼의 10 밀리리터에 하룻밤 셰이커에 배아를 배양하여 알이 부화하고 L1 애벌레 단계에 남을 수 있도록 합니다.
셰이커에서 14시간 이상 지나면 L1 애벌레를 오토클레이브 워터로 세 번 씻어 애벌레가 방출한 페로몬을 제거하고 애벌레 펠릿을 1밀리리터의 물로 되돌립니다. 벌레의 알리쿼트를 1 대 10 비율로 희석하고 유리 슬라이드에 1:10 마이크로리터 드롭을 추가하고 스테레오 현미경으로 웜을 계산합니다. 평균 웜 수를 얻으려면 반복합니다.
파이펫을 사용하여 웜 용액의 충분한 액적을 실온 NA22 플레이트에 추가하여 배양에 대한 세 번째 웜에 약 10번 을 시드하고 방울이 건조해질 때까지 플레이트절반을 열어 둡니다. 그런 다음 약 44~48시간 동안 또는 벌레가 스테레오 현미경으로 시각적으로 확인된 대로 L4 단계에 도달할 때까지 20도에서 거꾸로 덮인 플레이트를 배양합니다. SWIP의 수동 평가를 위해 0.5 밀리몰라 암페타민의 유무에 관계없이 40 마이크로리터의 제어 용액을 유리 스팟 플레이트에 넣으세요.
스테레오스코프 에서 속눈썹 픽으로 8~10개의 후반 L4 스테이지 웜을 선택하고 웜이 픽에서 벗어나 용액으로 수영할 때까지 용액을 포함하는 우물에 픽을 잠급합니다. 타이머를 시작합니다. 우물에 방출된 웜수를 기록하고 총 10분 동안 각 분 마크에 SWIP를 나타내는 웜 수를 관찰하고 기록합니다.
절차가 끝나면 원시 데이터를 스프레드시트에 복사하고 분석 전반에 걸쳐 테스트된 총 웜 수와 100을 곱하여 매 분마다 마비된 웜 수를 나누어 마비된 웜의 백분율을 계산합니다. 백분율 값을 그래프 및 통계 소프트웨어에 복사하고 XY 그래프 형식을 사용하여 x축에서 SWIP값과 시간을 사용하여 데이터를 플롯합니다. 대조군 및 암페타민 처리군 간의 통계적 분석은 예를 들어 양방향 ANOVA 및 사후 Hoc 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
수영으로 인한 마비를 자동화분석하기 위해 카메라, 웜 트래커 소프트웨어 및 스크립트를 설정하여 추적 소프트웨어 분석을 실행하고 속눈썹 픽을 사용하여 앞서 표시된 것처럼 단일 후반 단계 L4 웜을 유리 스팟 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 한 번에 하나의 웜의 수영 비디오를 기록하고 웜 트래커 소프트웨어를 사용하여 웜 스래싱 주파수를 얻기 위해 추적 소프트웨어와 함께 제공된 스크립트에 따라 바디 굽힘 빈도를 계산하고 웜 스래싱 데이터에서 열 맵을 생성합니다. 제어 솔루션에서 테스트된 대부분의 웜은 최소 10분 동안 지속적으로 수영합니다.
제어 또는 암페타민에 노출 된 벌레는 관찰의 첫 번째 분에 SWIP를 표시하지 않습니다. 그러나, 제어 용액으로 처리된 벌레가 10 분 동안 계속 수영하는 동안, 암페타민으로 취급된 벌레는 처리의 2 분 후에 SWIP를 전시하기 시작합니다. 그리고 10 분 후, 동물의 66 %는 SWIP를 보여줍니다.
여기서 대조군또는 암페타민에 노출된 동물의 열지도의 예는 암페타민 처리동물에서 관찰되는 마비의 상당한 증가와 함께 나타난다. 이 분석서를 시도하기 전에 C.elegans의 피킹 및 개발 준비에 잘 익숙해져야합니다. SWIP 행동에 도파민 시스템의 참여는 도파민 단백질의 발현이 결여된 동물을 사용하거나 Reserpine을 사용한 도파민 소포의 고갈에 의해 확인되어야 합니다.
SWIP는 도파민제 시냅스에서 작용하는 약물의 작용 메커니즘에 관여하는 새로운 단백질을 식별하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.
