Dieses Protokoll skizziert die einfache Vorbereitung für die AFM-Bildgebung von extrazellulären Vesikeln in hydratisierten und ausgetrockneten Formen, deren elektrostatische Immobilisierung, Oberflächenscanning, vesical Identifikation sowie Datenanalyse und -interpretation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die bequeme elektrostatische Fixierung von Vesikeln auf der Hautoberfläche und die post-imaging-Analyse, um Formverzerrungen zu berücksichtigen, die durch Immobilisierung verursacht werden. Die erhaltenen Ergebnisse der Vesikelgrößen sind konsistent mit der Gold Standard CryoTEM Imaging, die kostspielige und herausfordernde Technik bleibt.
Wenn Sie ein neuer AFM-Benutzer sind, beginnen Sie mit der Charakterisierung von trockenen Proben, bevor Sie mit hydratisierten Proben fortfahren. Denn es gibt zahlreiche zusätzliche Faktoren, die sich auf die Anschaffung von hydratisierten Proben auswirken können. Um zu beginnen, isolieren Sie extrazelluläre Vesikel von einer Bioflüssigkeit, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
Als nächstes befestigen Sie eine Glimmerscheibe fest an einer magnetischen Edelstahl-Probenscheibe. Cleave die Glimmerscheibe mit einem scharfen Rasiermesser, um eine neue Schicht von Material zu belichten. Bei Raumtemperatur die Oberfläche des Glimmers zehn Sekunden lang mit hundert Mikrolitern einer zehnMillimolaren Nickel-II-Chloridlösung behandeln.
Dadurch wird die Ladung der Oberfläche von negativ in positiv geändert. Die Nickel-II-Chloridlösung mit einem fusselfreien Wisch- oder Blottingpapier ablöschen. Dann waschen Sie die Glimmeroberfläche dreimal mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie mit einem Strom trockenen Stickstoffs.
Legen Sie die AFM-Probenscheibe mit der befestigten Oberfläche modifizierten Glimmer in eine Petrischale. Als nächstes verdünnen Sie die Exosomen mit PBS, um eine Konzentration zwischen vier und vierzig Milliarden Partikel pro Milliliter Lösung zu erhalten. Validieren Sie die verdünnte Partikelkonzentration mithilfe einer Nanopartikel-Tracking-Analyse.
Bilden Sie einen sessilen Tropfen auf der Oberfläche des Glimmers, indem Sie hundert Mikroliter der verdünnten Exosomenlösung aus einer Pipette entleeren. Dann den Deckel auf die Petrischale legen und mit Parafenfolie versiegeln, um die Probenverdunstung zu reduzieren. Zwölf Stunden im Kühlschrank bebrüten.
Nach der Inkubation 80 bis 90 Prozent der Probe sorgfältig aspirieren, ohne die Oberfläche zu stören. An dieser Stelle werden die Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf dem Glimmersubstrat. Bei der Abbildung hydratisierter Proben die Oberfläche dreimal mit PBS abspülen.
Achten Sie darauf, die Probe während des Spülvorgangs hydratisiert zu halten. Nach dem Waschen der Glimmeroberfläche mit PBS, entfernen Sie 80 bis 90 Prozent der Flüssigkeit und Pipette vierzig Mikroliter frische PBS, um die Probe zu bedecken. Die hydratisierte Probe ist zur Bildgebung bereit.
Bei der Abbildung der ausgetrockneten Eves entfernen Sie die Salze von der Oberfläche, indem Sie das Substrat dreimal mit entionisiertem Wasser abspülen. Nach dem Ansaugen so viel Flüssigkeit wie möglich, ohne die Oberfläche zu berühren, trocknen Sie den Rest mit einem Strom von trockenem Stickstoff. Um die ausgetrockneten extrazellulären Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Freischwinger aus, der für das Scannen in der Luft in abstichenden und berührungslosen Bildgebungsmodi entwickelt wurde, und montieren Sie ihn auf den Sondenhalter.
Platzieren Sie das Sample auf der AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die Probe auf der Bühne immobilisieren. Legen Sie den Sondenhalter in den AFM.
Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die Bühne, um thermisch auszueinemt. Verwenden Sie den Tippmodus, um einen Bereich zu scannen, der 5x5 Mikrometer in 512 Zeilen mit einer Scanrate von einem Hertz gerastert ist. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder, da sie kostenlose Informationen über die Topographie und die Oberflächeneigenschaften der Probe bereitstellen.
Die Scanzeit wird mit einem abgebildeten Bereich und der Anzahl der Linien, die für die Bildbildung ausgewählt wurden, erhöht, nimmt jedoch mit der Scanrate ab. Da sich schnelle Scanraten auf die Bildqualität auswirken können, sollte die Geschwindigkeit des Rasterns ein Gleichgewicht zwischen Erfassungszeit und Bildqualität sein. Um hydratisierte Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Ausleger aus, der zum Scannen weicher, hydratisierter Proben geeignet ist, und montieren Sie den Ausleger auf einen Sondenhalter, der für das Scannen in Flüssigkeiten entwickelt wurde.
Befeuchten Sie die Spitze des Auslegers mit PBS, um die Wahrscheinlichkeit des Einbringens von Luftblasen in die Flüssigkeit während des Scannens zu reduzieren. Anschließend wird die Probe auf die AFM-Bühne immobilisiert. Sobald die Probe thermisch ausgeglichen ist, stellen Sie die hydratisierte Glimmeroberfläche im Gewindebohrmodus ab.
Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, gehen Sie zuerst zu Data Process'select SPM-Modi, gefolgt von Tip'and wählen Sie Modellspitze'Wählen Sie die Geometrie und die Abmessungen der Spitze verwendet, um die Probe zu scannen und klicken Sie auf OK'Korrigieren Sie die Spitze Erosion Artefakte durch die Durchführung der Oberflächenrekonstruktion. Öffnen Sie das Bild.
Wählen Sie im Menü Datenprozess aus, wählen Sie dann SPM-Modi'followed by Tip'then wählen Sie Surface Reconstruction'and click OK'Next, select Data Process, gefolgt von Level'and choose Plane Level'to align the imaging plane and to match the laboratory XY plane by removing the tilt in the subxanders from the scan data. Richten Sie Zeilen im Bild aus, indem Sie Data Process'followed by Correct Data' auswählen und dann Rows ausrichten'Mehrere Ausrichtungsoptionen sind verfügbar, einschließlich Median, der ein Algorithmus ist, der eine durchschnittliche Höhe jeder Scanlinie findet und sie von den Daten subtrahiert. Als nächstes gehen Sie zu Datenprozess'followed by Correct Data'and choose Remove Scars'This remove common scanning errors known as Scars'To align the mica surface at the zero height, go to the Data Process'menu and choose Flatten Base'in the Level'drop down menu.
Identifizieren Sie die zusätzlichen zellulären Vesikel auf der gescannten Oberfläche, indem Sie zum Menü "Korn" gehen und Mark by Threshold verwenden: Dieser Algorithmus identifiziert oberflächenimmobilisierte Exosomen als Partikel, die aus dem Null-Oberflächensubstrat um die Höhe über dem vom Benutzer ausgewählten Schwellenwert herausragen. Wählen Sie einen Schwellenwert im Bereich zwischen einem und drei Nanometern aus. Dadurch wird der größte Teil der Bodeninterferenzen beseitigt.
Führen Sie schließlich die geometrische und dimensionale Charakterisierung der identifizierten Vesikel mithilfe der verfügbaren Verteilungsalgorithmen durch, auf die über das Menü "Grains" zugegriffen werden kann. Exportieren Sie die AFM-Daten aus Gwyddion für eine spezielle Analyse durch andere Rechenwerkzeuge und benutzerdefinierte Computerprogramme. Die Nickelchlorid-Oberflächenmodifikation führt zu einer zeitabhängigen Immobilisierung von extrazellulären Vesikeln.
Die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel ist nach 24 Stunden Inkubation zu dicht, während die 12-stündige Inkubation zu weniger Exosomen und Scandaten führt, die leichter genau zu analysieren sind. Dieses AFM-Bild zeigt hydratisierte MCF7-Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf der modifizierten Glimmeroberfläche. Das entsprechende AFM-Phasenbild bestätigt, dass es sich bei den Körnern im Höhenbild um weiche Nanopartikel handelt, wie es bei Membranbläschen zu erwarten ist.
Die Höhendaten für drei Vesikel entlang der gleichen Linie werden hier angezeigt. Diese Profile veranschaulichen eine abgeflachte Form, die durch die elektrostatische Anziehung von Exosomen auf die positiv aufladende Oberfläche des modifizierten Glimmers verursacht wird. Die Formverzerrung zeigt sich in einer vergrößerten Ansicht des immobilisierten Vesikels und seines Querschnitts.
Um die Kugelgröße der Exosomen in der Lösung zu schätzen, kann auf die Volumina entsprechen, die von oberflächenimmobilisierten und kugelförmigen Membranhüllen eingeschlossen sind. Die Größenverteilung der Kugelbläschen in der Lösung wurde aus den AFM-Daten von 561 immobilisierten Vesikeln bestimmt. Die Vesikelgrößen in CryoTEM-Bildern stimmen mit den AFM-Ergebnissen überein.
Vor der Abbildung der hyrdierten Exosomen ist es wichtig, daran zu denken, die Oberfläche gründlich mit PBS zu spülen. Dadurch werden eingehende Exosomen entfernt und deren Befestigung an der AFM-Spitze verhindert. Achten Sie bei der Abbildung der ausgetrockneten Exosomen darauf, DI-Wasser zu verwenden, um das Substrat zu erheben.
Die DI-Wäsche verhindert die Bildung von Salzkristallen auf der Oberfläche, wenn das Substrat trocknet. Wenn vorhanden, werden Salzkristalle die Bildverarbeitung zu einer schwierigen Aufgabe machen.
