Ce protocole décrit la préparation simple pour l’imagerie afm des vésicules extracellulaires sous forme hydratée et dessiccated, leur immobilisation électrostatique, balayage de surface, identification vésicale, et analyse et interprétation de données. Le principal avantage de cette technique est la fixation électrostatique pratique des vésicules à la surface de la peau et l’analyse post-imagerie pour tenir compte de la distorsion de forme causée par l’immobilisation. Les résultats obtenus de dimensionnement de vésicules sont compatibles avec l’imagerie cryoTEM d’étalon-or qui reste technique coûteuse et provocante.
Si vous êtes un nouvel utilisateur d’AFM, commencez par caractériser les échantillons secs avant de procéder à des échantillons hydratés. Parce qu’il existe de nombreux facteurs supplémentaires qui peuvent avoir un impact sur l’acquisition d’échantillons hydratés. Pour commencer, isoler les vésicules extracellulaires d’un bio-fluide tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne.
Ensuite, fixez fermement un disque de mica à un disque magnétique en acier inoxydable. Fendre le disque de mica à l’aide d’un rasoir tranchant pour exposer une nouvelle couche de matériau. À température ambiante, traiter la surface supérieure du mica pendant dix secondes avec une centaine de micro-litres d’une solution de chlorure nickel II de dix millimlaires.
Cela modifie la charge de la surface de négatif à positif. Éponger la solution de chlorure nickel II avec un lingette sans peluche ou du papier buvard. Ensuite, lavez la surface du mica trois fois avec de l’eau déionisée et séchez-la avec un jet d’azote sec.
Placez le disque de spécimen d’AFM avec la surface attachée mica modifiée dans une boîte de Pétri. Ensuite, diluer les exosomes avec PBS pour obtenir une concentration entre quatre et quarante milliards de particules par millilitre de solution. Valider la concentration de particules diluées à l’aide d’une analyse de suivi des nanoparticules.
Former une goutte sessile à la surface de la mica en vidant une centaine de microlitres de la solution exosome diluée à partir d’une pipette. Placez ensuite le couvercle sur la boîte de Pétri et scellez-le avec du film de parafène pour réduire l’évaporation de l’échantillon. Incuber au réfrigérateur pendant douze heures.
Après l’incubation, aspirer 80 à 90 pour cent de l’échantillon avec soin sans déranger la surface. À ce stade, les exosomes seront immobilisés électrostatiquement sur le substrat de mica. Lors de l’imagerie des échantillons hydratés, rincer la surface trois fois avec PBS.
Prenez soin de garder l’échantillon hydraté tout au long du processus de rinçage. Après avoir lavé la surface mica avec PBS, retirer 80 à 90 pour cent du liquide et pipette quarante microlitres de PBS frais pour couvrir l’échantillon. L’échantillon hydraté est prêt pour l’imagerie.
Lors de l’imagerie des EV desséchés, retirer les sels de la surface en rinçant le substrat trois fois avec de l’eau déionisée. Après avoir aspiré autant de liquide que possible, sans toucher la surface, séchez le reste avec un jet d’azote sec. Pour imager les vésicules extracellulaires desséchées, sélectionnez un porte-à-faux conçu pour la numérisation en l’air en mode d’imagerie tapant et sans contact et montez-le sur le porte-sonde.
Placez l’échantillon sur la scène de l’AFM. Le disque magnétique en acier inoxydable immobilise l’échantillon sur la scène. Placez le porte-sonde dans l’AFM.
Laisser le temps à la préparation et au stade d’équilibrer thermiquement. Utilisez le mode taraudage pour scanner une zone de 5x5 microns rastered en 512 lignes à un taux de balayage d’un hertz. Obtenez à la fois les images de hauteur et de phase car elles fournissent des informations complémentaires sur la topographie et les propriétés de surface de l’échantillon.
Le temps d’analyse augmentera avec une zone d’image et le nombre de lignes sélectionnées pour former l’image, mais diminuera avec le taux d’analyse. Étant donné que des taux d’analyse rapides peuvent avoir un impact sur la qualité de l’image, la vitesse de rastering devrait être un équilibre entre le temps d’acquisition et la qualité de l’image. Pour imager les vésicules hydratées, choisissez un porte-à-faux qui convient à la numérisation d’échantillons mous et hydratés et montez le porte-à-faux sur un porte-sonde conçu pour la numérisation des liquides.
Mouiller la pointe du porte-à-faux avec PBS pour réduire la probabilité d’introduire des bulles d’air dans le liquide pendant la numérisation. Ensuite, immobiliser l’échantillon sur la scène de l’AFM. Une fois que l’échantillon équilibre thermiquement, imagez la surface hydratée de mica en mode taraudage.
Acquérir à la fois les images de hauteur et de phase. Pour analyser les images prises, passez d’abord aux modes SPM sélectionnés de Data Process, suivis de Tip’and choose Model Tip’Select, la géométrie et les dimensions de la pointe utilisée pour numériser l’échantillon et cliquez sur OK’Corriger les artefacts d’érosion de pointe en effectuant la reconstruction de surface. Ouvrez l’image.
Dans le menu, sélectionnez Data Process’then sélectionnez SPM Modes’followed by Tip’then choose Surface Reconstruction’and click OK’Next, sélectionnez Data Process, suivi de Level’and choose Plane Level’to aligne le plan d’imagerie et correspond au plan XY de laboratoire en supprimant l’inclinaison du substrat des données de balayage. Alignez les lignes dans l’image en sélectionnant Data Process’followed by Correct Data', puis choisissez Align Rows’Plusieurs options d’alignement sont disponibles, y compris la médiane qui est un algorithme qui trouve une hauteur moyenne de chaque ligne d’analyse et la soustrait des données. Ensuite, allez à Data Process’followed by Correct Data’and choose Remove Scars’This supprimera les erreurs de numérisation courantes connues sous le nom de Scars’To aligner la surface mica à la hauteur zéro, aller au menu du processus de données et sélectionnez Flatten Base’in the Level’drop down menu.
Identifiez les vésicules extracellulaires sur la surface numérisée en vous rendre au menu grains et en utilisant l’algorithme Mark by Threshold’This identifie les exosomes immobilisés de surface comme des particules qui dépassent du substrat de surface zéro par la hauteur au-dessus du seuil choisi par l’utilisateur. Sélectionnez un seuil de l’espace entre un et trois nanomètres. Cela éliminera la plupart des interférences au sol arrière.
Enfin, effectuez la caractérisation géométrique et dimensionnelle des vésicules identifiées à l’aide des algorithmes de distribution disponibles accessibles à partir du menu grains. Exportez les données AFM de Gwyddion pour analyse spécialisée par d’autres outils informatiques et programmes informatiques personnalisés. La modification de la surface du chlorure de nickel entraîne une immobilisation des vésicules extracellulaires qui dépendent du temps.
La concentration en surface des vésicules immobilisées est excessivement dense après 24 heures d’incubation, tandis que l’incubation de 12 heures entraîne moins d’exosomes et de données de balayage plus faciles à analyser avec précision. Cette image AFM montre des exosomes MCF7 hydratés électrostatiquement immobilisés sur la surface modifiée du mica. L’image correspondante de la phase AFM confirme que les grains de l’image de hauteur sont des nanoparticules molles comme il faut s’y attendre pour les vésicules membranaires.
Les données de hauteur pour trois vésicules le long de la même ligne sont affichées ici. Ces profils illustrent une forme aplatie causée par l’attraction électrostatique des exosomes à la surface de charge positive du mica modifié. La distorsion de forme est apparente dans une vue agrandie de la vésicule immobilisée et de sa section transversale.
Pour estimer la taille globulaire des exosomes de la solution, on peut correspondre aux volumes enfermés par des enveloppes membranaires immobilisées et sphériques de surface. La distribution de taille des vésicules globulaires dans la solution a été déterminée à partir des données d’AFM de 561 vésicules immobilisées. Les tailles vésicules des images CryoTEM sont compatibles avec les résultats de l’AFM.
Avant d’imaginer les exosomes hyrdrated, il est important de se rappeler de bien rincer la surface avec PBS. Cela supprimera les exosomes entrants et empêchera leur attachement à la pointe AFM. Lors de l’imagerie des exosomes desséchés, assurez-vous d’utiliser de l’eau DI pour élever le substrat.
Le lavage di empêchera la formation de cristaux de sel à la surface pendant que le substrat sèche. S’ils sont présents, les cristaux de sel feront du traitement d’image une tâche difficile.
