该协议概述了以水合和干燥形式对细胞外囊泡进行 AFM 成像的简单准备、静电固定、表面扫描、体形识别以及数据分析和解释。该技术的主要优点是方便的静电固定囊泡在皮肤的表面和后成像分析，以考虑到形状变形造成的固定。获得的囊泡尺寸结果与黄金标准 CryoTEM 成像一致，该成像技术仍然成本高昂且具有挑战性。
如果您是 AFM 的新用户，请先从干样品的表征开始，然后再进行水合样品。因为有很多其他因素会影响水合样品的采集。首先，将细胞外囊泡与生物流体分离，如随附的文本协议所述。
接下来，将云母盘牢固地连接到磁性不锈钢试样盘上。使用锋利的剃须刀切割云母盘，露出新的材料层。在室温下，用100微升的十毫摩尔镍II氯化物溶液处理云母的顶面十秒钟。
这会将表面电荷从负向正。用无绒擦拭或印迹纸将镍二氯化物溶液打上。然后，用去维化的水洗三次云母表面，然后用干氮流干燥。
将 AFM 试样盘与附加表面修饰的云母放入培养皿中。接下来，用PBS稀释外体，获得每毫升溶液40亿到40亿颗粒的浓度。使用纳米颗粒跟踪分析验证稀释颗粒浓度。
通过从移液器中排空稀释的外体溶液的一百微升，在云母表面形成一个酶滴。然后将盖子盖在培养皿上，用副芬膜密封，以减少样品蒸发。在冰箱里孵育十二小时。
孵育后，小心吸吸80%至90%的样品，而不干扰表面。此时，外显体将在云母基材上静电固定。成像水合样品时，用 PBS 冲洗表面三次。
注意在整个冲洗过程中保持样品水分。用 PBS 清洗云母表面后，取出 80% 至 90% 的液体和移液器 40 微升新鲜 PBS 以覆盖样品。水合样品已准备好进行成像。
成像干燥 EV 时，用去电化水冲洗基材三次，将盐从表面去除。尽可能多地吸气液体后，在不接触表面的情况下，用干氮流干燥其余液体。要对干燥细胞外囊泡进行成像，请选择一个悬臂，用于在攻丝和非接触式成像模式下在空中扫描，然后安装到探头支架上。
将样品放在 AFM 阶段。磁性不锈钢试样盘将固定样品在舞台上。将探针支架放入 AFM 中。
留出时间进行准备和阶段以热平衡。使用攻丝模式扫描 5x5 微米以 1 赫兹的扫描速率在 512 行中拉的面积。获取高度和相位图像，因为它们提供有关样品的地形和表面属性的免费信息。
扫描时间将随着图像区域和选择形成图像的行数而增加，但扫描速率也会减少。由于快速扫描速率可能会影响图像质量，因此栅格速度应该是采集时间和图像质量之间的平衡。要成像水合囊泡，请选择适合扫描软水合样品的悬臂，然后将悬臂安装到专为液体扫描而设计的探针支架上。
用 PBS 将悬臂的尖端弄湿，以减少扫描过程中向液体引入气泡的可能性。然后，将样品固定到 AFM 阶段。样品热平衡后，在攻丝模式下对水合云母表面进行成像。
获取高度和相位图像。要分析拍摄的图像，请先转到"数据处理"选择 SPM 模式，然后选择"模型提示"，然后选择用于扫描样本的图尖的几何形状和尺寸，然后单击"确定"，通过执行曲面重建来校正尖端侵蚀伪影。打开图像。
从菜单中，选择"数据过程"，然后选择"SPM模式"，然后选择"提示"，然后选择"确定""下一步"，选择"数据处理"，然后选择"平面"，然后选择"平面"来对齐成像平面，通过从扫描数据中删除基板中的倾斜度来匹配实验室 XY 平面。通过选择"数据过程"，然后选择"对齐行"来对齐图像中的行，然后选择"对齐行""几个对齐选项可用，包括中位数，这是一种算法，用于查找每条扫描线的平均高度并从数据中减去它。接下来，转到"数据处理"，然后选择"删除疤痕"，这将删除常见的扫描错误，称为疤痕'以零高度对齐云母表面，转到数据处理'菜单，并在"级别"下拉菜单中选择"平展基础"。
通过进入颗粒菜单并使用"阈值标记"来识别扫描表面上的额外细胞囊泡。该算法将表面固定外体识别为从零表面基板突出的颗粒，其高度高于用户所选阈值。选择一到三纳米范围内的阈值。这将消除大部分后场干扰。
最后，使用从谷物菜单访问的可用分布算法对已识别的囊泡进行几何和尺寸特征化。导出 Gwydion 的 AFM 数据，由其他计算工具和自定义计算机程序进行专业分析。氯化镍表面的改性导致额外的细胞囊泡的固定化，这需要时间。
固定囊泡的表面浓度在孵育24小时后过于密集，而12小时的孵育导致的外体更少，扫描数据更容易准确分析。此 AFM 图像显示了水合的 MCF7 外体静电固定在经过修改的云母表面。相应的 AFM 相位图像确认高度图像中的颗粒是软纳米颗粒，应视为膜囊泡的软纳米颗粒。
此处显示了同一行中三个囊泡的高度数据。这些轮廓说明了外显子对改性云母的正电荷表面的静电吸引力造成的扁平形状。形状失真在固定囊泡及其横截面的放大视图中是明显的。
要估计溶液中外显体球状大小，上可与表面固定膜和球形膜包络所包围的体积相匹配。溶液中球状囊泡的大小分布由 561 个固定囊泡的 AFM 数据确定。CryoTEM 图像中的囊泡大小与 AFM 结果一致。
在成像经过赞美的外体之前，重要的是要记住用PBS彻底冲洗表面。这将删除入站外体，并防止它们附着在 AFM 提示中。成像干燥外显体时，请务必使用 DI 水来上升基材。
当基板干燥时，DI 洗涤将防止表面形成盐晶体。如果存在，盐晶体将使图像处理成为一项艰巨的任务。
