Este protocolo describe la preparación simple para la toma de imágenes AFM de vesículas extracelulares en formas hidratadas y desecadas, su inmovilización electrostática, escaneo de superficies, identificación vesical y análisis e interpretación de datos. La principal ventaja de esta técnica es la conveniente fijación electrostática de las vesículas en la superficie de la piel y el análisis post-imagen para tener en cuenta la distorsión de la forma causada por la inmovilización. Los resultados obtenidos del tamaño de las vesículas son consistentes con las imágenes CryoTEM estándar de oro, que sigue siendo una técnica costosa y desafiante.
Si usted es un nuevo usuario de AFM, comience con la caracterización de muestras secas antes de proceder a muestras hidratadas. Porque hay numerosos factores adicionales que pueden afectar la adquisición de muestras hidratadas. Para empezar, aísle las vesículas extracelulares de un bio fluido como se describe en el protocolo de texto adjunto.
A continuación, fije firmemente un disco de mica a un disco de muestra de acero inoxidable magnético. Corte el disco de mica usando una maquinilla de afeitar afilada para exponer una nueva capa de material. A temperatura ambiente, tratar la superficie superior de la mica durante diez segundos con cien micro litros de una solución de cloruro de níquel II de diez milimolar.
Esto modifica la carga de la superficie de negativa a positiva. Borre la solución de cloruro de níquel II con una toallita libre de pelusas o papel hinchado. A continuación, lave la superficie de mica tres veces con agua desionizada y séquela con una corriente de nitrógeno seco.
Coloque el disco de muestra AFM con la mica modificada de superficie adjunta en una placa de petri. A continuación, diluir los exosomas con PBS para obtener una concentración entre cuatro y cuarenta mil millones de partículas por mililitro de solución. Validar la concentración de partículas diluida mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas.
Forme una gota sésil en la superficie de la mica vaciando cien microlitros de la solución de exosoma diluida de una pipeta. A continuación, coloque la tapa en el plato de petri y séquelo con película de parafen para reducir la evaporación de la muestra. Incubar en el frigorífico durante doce horas.
Después de la incubación, aspirar 80 a 90 por ciento de la muestra cuidadosamente sin perturbar la superficie. En este punto, los exosomas serán electrostáticamente inmovilizados en el sustrato de mica. Cuando haga imágenes de muestras hidratadas, enjuague la superficie tres veces con PBS.
Tenga cuidado de mantener la muestra hidratada durante todo el proceso de enjuague. Después de lavar la superficie de mica con PBS, retire entre el 80 y el 90 por ciento del líquido y pipetee cuarenta microlitros de PBS fresco para cubrir la muestra. La muestra hidratada está lista para la toma de imágenes.
Al tomar imágenes de los EV desecados, retire las sales de la superficie enjuagando el sustrato tres veces con agua desionizada. Después de aspirar tanto líquido como sea posible, sin tocar la superficie, seque el resto con una corriente de nitrógeno seco. Para obtener imágenes de las vesículas extracelulares desecadas, seleccione un voladizo diseñado para escanear en el aire en los modos de toma de imágenes de roscado y sin contacto y colóquelo en el soporte de la sonda.
Coloque la muestra en la etapa AFM. El disco magnético de la muestra de acero inoxidable inmovilizará la muestra en el escenario. Coloque el soporte de la sonda en el AFM.
Deje tiempo para que la preparación y la etapa se equilibren térmicamente. Utilice el modo de roscado para escanear un área de 5x5 micras rasterizadas en 512 líneas a una velocidad de escaneo de un hercio. Adquiera las imágenes de altura y fase, ya que proporcionan información gratuita sobre la topografía y las propiedades de superficie de la muestra.
El tiempo de escaneo aumentará con un área de imagen y el número de líneas seleccionadas para formar la imagen, pero disminuirá con la velocidad de escaneo. Dado que las velocidades de escaneo rápidas pueden afectar a la calidad de la imagen, la velocidad de rasteración debe ser un equilibrio entre el tiempo de adquisición y la calidad de la imagen. Para tomar imágenes de vesículas hidratadas, seleccione un voladizo adecuado para escanear muestras suaves e hidratadas y monte el voladizo en un soporte de sonda diseñado para escanear en líquidos.
Humedezca la punta del voladizo con PBS para reducir la probabilidad de introducir burbujas de aire en el líquido durante el escaneo. A continuación, inmovilice la muestra en la etapa AFM. Una vez que la muestra se equilibra térmicamente, imagen de la superficie de mica hidratada en modo de roscado.
Adquiera las imágenes de altura y fase. Para analizar las imágenes tomadas, primero vaya a los modos SPM seleccionados del Proceso de datos, seguido de Tip'y elija Model Tip'Select the geometry and the dimensions of the tip used to scan the sample and click ok'Correct the tip artifact erosions byperforming the surface reconstruction. Abra la imagen.
En el menú, seleccione Proceso de datos', seleccione Modos SPM', seguido de Tip', elija Reconstrucción de superficie' y haga clic en Aceptar'Siguiente, seleccione Proceso de datos, seguido de Nivel' y elija Nivel de plano'para alinear el plano de imagen y para que coincida con el plano XY de laboratorio eliminando la inclinación en el sustrato de los datos de escaneado. Alinee filas en la imagen seleccionando Proceso de datos'seguido de Datos correctos' y luego elija Alinear filas'Varias opciones de alineación están disponibles, incluyendo la mediana que es un algoritmo que encuentra una altura media de cada línea de exploración y la resta de los datos. A continuación, vaya a Proceso de datos'seguido por Datos correctos' y elija Eliminar cicatrices'Esto eliminará los errores de escaneo comunes conocidos como Cicatrices'Para alinear la superficie de mica a la altura cero, vaya al menú Proceso de datos'y seleccione Aplanar base'en el menú desplegable Nivel'.
Identifique las vesículas celulares adicionales en la superficie escaneada yendo al menú De los granos y usando Mark by Threshold'Este algoritmo identifica los exosomas inmovilizados de la superficie como partículas que sobresalen del sustrato de superficie cero por la altura por encima del umbral seleccionado por el usuario. Seleccione un umbral en el rango entre uno y tres nanómetros. Esto eliminará la mayor parte de la interferencia del fondo del suelo.
Por último, realice la caracterización geométrica y dimensional de las vesículas identificadas utilizando los algoritmos de distribuciones disponibles accesibles desde el menú de los granos. Exporte los datos de AFM de Gwyddion para análisis especializados por otras herramientas computacionales y programas informáticos personalizados. La modificación de la superficie del cloruro de níquel da como resultado una inmovilización de vesículas celulares adicionales que depende del tiempo.
La concentración superficial de las vesículas inmovilizadas es excesivamente densa después de 24 horas de incubación, mientras que la incubación de 12 horas conduce a menos exosomas y datos de escaneo que son más fáciles de analizar con precisión. Esta imagen de AFM muestra exosomas hidratados MCF7 electrostáticamente inmovilizados en la superficie de mica modificada. La imagen de fase AFM correspondiente confirma que los granos de la imagen de altura son nanopartículas suaves como se debe esperar para las vesículas de membrana.
Los datos de altura de tres vesículas a lo largo de la misma línea se muestran aquí. Estos perfiles ilustran una forma aplanada causada por la atracción electrostática de los exosomas a la superficie de carga positiva de la mica modificada. La distorsión de la forma es evidente en una visión ampliada de la vesícula inmovilizada y su sección transversal.
Para estimar el tamaño globular de los exosomas en la solución, on puede coincidir con los volúmenes encerrados por envolventes de membrana inmovilizados y esféricos de superficie. La distribución del tamaño de las vesículas globulares en la solución se determinó a partir de los datos AFM de 561 vesículas inmovilizadas. Los tamaños de vesículas en las imágenes de CryoTEM son consistentes con los resultados de AFM.
Antes de tomar imágenes de los exosomas hyrdrated, es importante recordar enjuagar bien la superficie con PBS. Esto eliminará los exosomas entrantes y evitará su fijación a la punta de AFM. Cuando haga una toma de imágenes de los exosomas desecados, asegúrese de utilizar agua DI para elevar el sustrato.
El lavado DI evitará la formación de cristales de sal en la superficie a medida que el sustrato se seca. Si están presentes, los cristales de sal harán que el procesamiento de imágenes sea una tarea difícil.
