في هذا البروتوكول نحن بالتفصيل نموذج في المختبر من اعتلال التوابع البشرية. هذه الطريقة تملأ الحاجة المواد التي قد تكون مفيدة لفحص المخدرات ودراسات آلية المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذج ثقافة الخلية يسمح بإجراء تقييم أسرع لسمية تاو والعلاجات المحتملة تاو مقارنة بالدراسات الحيوانية لبدء هذا الإجراء ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لطلاء الألواح الزرعية عند أربع درجات مئوية.
جعل aliliter ملليلتر واحد وتخزينها في ناقص 20 أو ناقص 70 درجة مئوية. بعد ذلك، إعادة تشكيل عامل النمو الليفي الأساسي في برنامج تلفزيوني عقيمة بتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. جعل 10 ميكرولتر aliquots وتخزينها في أربع درجات مئوية.
ثم وضعت خارج زجاجة جديدة غير مفتوحة 500 ملليلتر من DMEM-F12 مع الجلوتامين. إضافة 10 ملليلتر من B27، وخمسة ملليلتر من N2، وخمسة ملليلتر من البنسلين ستربتوميسين لإعداد وسائل الإعلام الخلايا الجذعية العصبية. ضع 50 ملليلتر من وسائط NSC في أنبوب مخروطي ، وأضف 10 ميكرولترات من bFGF المعدة.
تخزين هذه NSC بالإضافة إلى وسائل الإعلام bFGF في أربع درجات مئوية. أولا، إزالة aliquot من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المجمدة طلاء للوحات ثقافة الخلية من الثلاجة والسماح للذوبان في أربع درجات مئوية. إضافة 385 ميكرولترات من طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي المذاب إلى خمسة ملليلترات من وسائل الإعلام DMEM-F12 التي تحتوي على البنسلين-ستريبتوميسين.
إذا تم إذابة الخلايا من مخزونات NSC المجمدة، تأخذ قارورة من الخلايا المجمدة من الثلاجة وتدفئة في حمام مائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. بعد هذا، رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم تحت غطاء الخلية ثقافة، نقل الخلايا إلى ما يقرب من 10 ملليلتر من وسائل الاعلام DMEM-F12 التي تحتوي على البنسلين-ستريبتوميسين.
جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 1000 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تُشعّر الوسائط وتُعيد تعليق الخلايا في وسائط المركز الوطني لC. تخفيف الخلايا في وسائط NSC للحصول على كثافة البذر المناسبة للسفينة ثقافة الخلية التي يتم استخدامها.
إضافة ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائل الإعلام NSC لزرع مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة أطباق الثقافة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تكون 75 إلى 80٪التقاء، مع التأكد من تغيير وسائل الإعلام كل يومين. إلى الخلايا العصبية transduce مع العد، استخدام عدد تتر من 340،000 وحدات محولة لكل خلية.
تخفيف وحدات تحويل في وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى التركيز اللازم، وإضافتها إلى الخلايا. بعد يومين من إضافة فيروس العدس، وغسل الخلايا مرة واحدة مع وسائل الإعلام الطازجة التي لا تحتوي على bFGF. مواصلة زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في وسائل الإعلام دون bFGF.
الحفاظ على الخلايا لمدة ثمانية أسابيع بعد عملية النقل، مع التأكد من تغيير وسائل الإعلام خلية ثقافة كل يوم. استخدام المجهر الخفيف لتصور روتينية الخلايا وضمان البقاء. بعد عملية النقل، قم بإزالة أطباق الثقافة من الحاضنة مع التأكد من الحفاظ على الغطاء عليها للحفاظ على الثقافة معقمة بشكل جيد.
استخدام المجهر الفلورسنت قادرة على التصوير الخلية الحية لتصور الخلايا تحت هدف 10X مع استثارة من 514 نانومتر ومرشح انبعاث من 527 نانومتر. في هذه الدراسة الخلايا العصبية التي تم تحويلها مع تاو RDLM-YFP يتم وضع علامات الفلوري مع YFP. يتم رؤية الثقافات التي يتم تحويلها RDLM لعرض المجاميع بعد النقل.
هذه التضمين وصمة عار إيجابية للثيوفلافين. يتم تأكيد التمايز العصبي عن طريق التميّز من علامة بيتا-توبولين الثالث الخاصة بالخلايا العصبية في الثقافات. ومن المهم أن نتذكر أن الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورسنت ينبغي أن يكون لها طيف من الانبعاثات الإثارة لا يتداخل مع طيف YFP.
على الرغم من أن مجاميع الفلوريسنس تاو الصفراء ستكون مرئية في غياب تلطيخ، وينبغي أيضا أن تستخدم ثيوفلافين للتصوير من أجل التأكد من أن الإشارة الفلورسنت هي تاو تجميعها لا الحطام الخلوي. بعد جيل من الخلايا تاو overexpressing، يمكن إجراء عدد من التقييمات لصحة الخلايا العصبية وتجميع تاو. على سبيل المثال، وجدنا أن هذه الخلايا تعرض انحطاطاً عصبياً.
بالإضافة إلى دراسات زراعة الخلايا، استخدمنا هذه الطريقة لفحص تاو الإمراضية المشتقة من الزومات.
