مرحبا، أنا بن رين، أنا أستاذ مشارك في الجراحة والهندسة الطبية الحيوية في جامعة ألاباما كلية برمنغهام للطب. مختبرنا المهتمة على بيولوجيا الخلايا البطانية وظيفة الأوعية الدموية اكوجينيسيس في سياق هذه الأمراض القلبية الوعائية الشائعة والسرطانات. أحد أبحاثنا يركز على تنظيم اللاجينية والنسخ من التغاير بين الخلايا البطانية والتخلق الوعائي.
لفهم آليات النسخ من تولد الأوعية، أنشأنا خطوط الماوس المعدلة وراثيا هندسة، والتي قمنا ليس فقط حذف جينات محددة المرتبطة تولد الأوعية الدموية في الخلايا البطانية، ولكن سيتم وضع علامات وراثية على مسبار GFP تعزيز الريبوس من الخلايا البطانية الأصلية. وبهذه الطريقة، يمكننا عزل وتنقية حلقات من الحمض النووي الرسول المرتبطة من الخلايا البطانية في مختلف أعضاء الأنسجة مباشرة في الحيوانات المعدلة وراثيا. يمكننا بعد ذلك استخدام الحمض النووي رسول تنقية لتحليل المصب من النصوص ونسخ.
بواسطة تسلسل الجيش الملكي النيبالي والبرد في الوقت الحقيقي PCR. في هذا الفيديو ، وطلابي باتريك موران والأردن بالمر وفنيي البحث نيكولاس بارنيكو ورونغ يوان سوف تظهر لك نهج genotyping الفئران المعدلة وراثيا ورسول التعرق RNA مباشرة من endothelial في الحيوانات المعدلة وراثيا. Genotyping هو أولية هامة في هذا البروتوكول لضمان أن الجليد لديه علامة GFP على الريبوسومات من الخلايا البطانية.
وبما أن جميع الخطوات المعزولة RNAi المصبية تعتمد على وجود الريبوسومات الموسومة GFP، فمن الضروري تحديد النمط الجيني قبل بدء التجربة. قبل البدء في عزل الجيش الملكي النيبالي، يجب إكمال عدة خطوات تحضيرية. وتشمل هذه إعداد العازلة وربط الأجسام المضادة لGFP إلى الخرز G دينا البروتين.
ويمكن أن تستمر المخازن المؤقتة لمدة تصل إلى شهر واحد عند أربع درجات مئوية، ويمكن أن تستمر الخرزات المقيدة بالأجسام المضادة لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند أربع درجات مئوية. لذا خذ هذه القيود في الاعتبار عند تخطيط تجربتك. استخدام التجانس الولي يحركها هو وسيلة ممتازة لزيادة العائد RNA.
تأكد من استخدام إعدادات الترددات المنخفضة والمددّات من أجل تقليل تدهور الحمض النووي الريبي. وكما ذكر آنفا، فإن الإبادة الجماعية هي خطوة أولية هامة في بروتوكول المحاكمة. ضمان أن الفئران التي يتم عزلها RNA باستخدام تقنية TRAP إيجابية لجين TRAP ، على الأقل غير المتغايرة ، ولكن المثلية المثالية لجين TRAP هي خطوة مهمة لأن ضمان أن تكون علامة GFP على الريبوسوم أمر ضروري من أجل سحبها باستخدام رد فعل الأجسام المضادة والخرز المضاد لـ GFP الذي ستكون قد أعدته قبل بدء التجربة.
عزل الأنسجة المطلوبة من الفأر ووضعها على الفور في برنامج تلفزيوني بارد الجليد مع 100 ميكروغرام لكل ميلليلتر حل زلكلهيكساميد. وهذا يضمن وقف الترجمة وأن يكون النص تصويراً دقيقاً للماوس قبل القتل الرحيم. استخدام التجانس محرك يحركها لتجانس الأنسجة في تعليق الخلية.
توقيت مثالي وضبط التردد يجب أن يتم تحديدها من قبل مختبر الفردية على أساس التجانس محرك معين يحركها سوف تستخدم. يمكن أن يؤدي استخدام إعداد التردد العالي جدًا إلى تدهور الحمض النووي الريبي وتعطيل بقية البروتوكول. تعليق بيليه الخلية داخل العازلة تحلل يجب أن يكون قد أعد قبل بدء التجربة.
تأكد من تجانس هذا الخليط من أجل ضمان التجانس الكافي قبل الشروع في بقية البروتوكول. الطرد المركزي المتجانس لمدة 10 دقائق في 2،000 مرات G في جهاز طرد مركزي أربع درجات مئوية. وهذا سوف بيليه النوى والحطام الخلوي الكبير التي قد تتداخل مع تفاعل المناعة المصب.
إضافة DHPC و CA-630 الدهون إلى فائقة من خطوة الطرد المركزي السابقة. هذه الدهون سوف تساعد على فصل مراحل البروتين من المكونات الأخرى داخل الخلايا. ضع التعليق على الجليد لمدة خمس دقائق واسمح له بالجلوس.
الطرد المركزي لlysate لمدة 10 دقيقة في 13، 000 مرات G إلى بيليه أي مادة قابلة للذوبان. احتفظ بـ 15٪ من الـ 15 من الخطوات المستقبلية. إضافة المضادة للجسم المضاد GFP الخرز ملزمة إلى الخلية lysate supernatant واحتضان الخليط في أربع درجات مئوية مع نهاية على نهاية دوران لمدة 30 دقيقة.
هذا هو المكان الذي المضادة للأجسام المضادة لFP سوف تربط الريبوسومات الموسومة GFP، مما يسمح لنا لمزيد من عزل الجيش الملكي النيبالي من هذه الريبوسومات. جمع الخرز على الرف المغناطيسي الخاص بك وغسل الخرز خمس مرات باستخدام الخاص بك عالية الملح غسل بوليسوم العازلة التي سيكون لديك أعدت قبل بدء العزلة. مباشرةً انتقل إلى الخطوة التالية التي سوف تضع الخرز في المخزن المؤقت RLT.
الطرد المركزي لlysate لمدة ثلاث دقائق بأقصى سرعة وإزالة بعناية فائقة ونقلها إلى أنبوب جديد microfuge. إضافة حجم واحد من 70٪ الإيثانول إلى lysate مسح ومزيج على الفور عن طريق الأنابيب. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية التي ستنقل فيها ما يصل إلى 700 ميكرولترات من العينة ، بما في ذلك أي عجل قد تكون قد تشكلت ، إلى عمود الدوران الموضوع في أنبوب جمع ميليلتر اثنين.
الطرد المركزي لlysate لمدة 15 ثانية في أكبر من 8، 000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور. تجاهل التدفق من خلال ثم انتقل إلى الخطوة التالية. إضافة 350 ميكرولتررس من المخزن المؤقت RW1 إلى العمود تدور.
جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية في أكبر من 8،000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور وتجاهل تدفق من خلال. كرر هذه الخطوة باستخدام آخر 350 ميكرولترات من المخزن المؤقت RW1 قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إضافة 500 microliters من RPE العازلة إلى العمود تدور.
جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية في أكبر من 8،000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور. تجاهل تدفق خلال ثم متابعة لتكرار هذه الخطوة عن طريق إضافة 500 ميكرولترات آخر من RPE العازلة إلى العمود تدور. هذه المرة، الطرد المركزي لمدة دقيقتين في أكبر من 8.000 مرات G لغسل غشاء العمود تدور.
تجاهل التدفق من خلال ووضع العمود تدور في أنبوب جمع ملليلتر جديدة والمضي قدما إلى جهاز الطرد المركزي في سرعة كاملة لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي العازلة المتبقية التي قد تكون موجودة على العمود تدور. تجاهل التدفق من خلال وضع العمود تدور في أنبوب جمع 1.5 ملليلتر جديدة. المضي قدما لإضافة 30 إلى 50 ميكرولترات من المياه الحرة RNase مباشرة إلى غشاء العمود تدور.
أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في أكثر من 8،000 مرات G ل elute الجيش الملكي النيبالي من غشاء العمود تدور. عند هذه النقطة، يتم حل الحمض النووي الريبي الخاص بك في المياه الحرة RNase ويمكن تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. المضي قدما في تحديد النقاء والتحقق من نقاء الجيش الملكي النيبالي كنت قد عزلت باستخدام مقياس الطيف.
كنت تبحث عن ذروة في 260 نانومتر، وهو الحمض النووي، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي، يمتص أقصى حد. يتم تصوير الكمية في الجزء الأيمن السفلي من الصورة في نانوجرام لكل ميكرولتر. يمكن استنتاج الجودة بنسبة 260 230 التي تظهر عنصر واحد فوق الكمية في الجزء الأيمن السفلي من الشاشة.
أظهر نهجنا انخفاض عوائد الحمض النووي الريبي، خاصة عندما نطهر مرنا من أنسجة القلب أو من الأنسجة المجمدة سابقا. وبالتالي، نحن بحاجة إلى تهيئة الظروف لزيادة الغلة. ومع ذلك، لاحظنا في EC محددة CD-36 الفئران ناقص، تم زيادة مستوى افيران B2 وDLY 4 بشكل كبير في كل من الرئة والقلب endothelia، بالمقارنة مع السيطرة.
وكانت هذه النتائج متسقة مع الدراسات السابقة في المختبر، مما يشير إلى أن نوعية الحمض النووي الريبي كافية لتحليل المصب. كان العائد منخفضًا بسبب الشروط الصارمة في مساحة العمل الخاصة بنا. للتغلب على هذا القيد، من المهم إنشاء منطقة عمل حرة RNase وإزالة التلوث أسطح ومعدات العمل التي قد تحصل على الملوثة مع RNase وتغيير القفازات في كثير من الأحيان من أجل استخراج RNA الجودة وزيادة الغلة.
ومن الأهمية بمكان أيضا العثور على تركيزات مناسبة من الأجسام المضادة GFP في مصفوفة تقارب واستخدام تركيزات مناسبة من مثبط RNase في العازلة تحلل الأنسجة واستخدام RNase الحرة بلاستيكية وير والكواشف لاستخراج الحمض النووي الريبي من الريبوسومات البطانية من الأنسجة المستهدفة.
