Привет, я бин Рен, я адъюнкт-профессор хирургии и биомедицинской инженерии в Университете Алабамы Бирмингемской школы медицины. Наша лаборатория заинтересована в эндотелиальной клеточной биологии функции ангиогенеза акуогенеза в контексте этих распространенных сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Одно из наших исследований сосредоточено на эпигенетической и транскрипционные регуляции трансдифференцирования эндотелиальных клеток и ангиогенеза.
Чтобы понять транскрипционные механизмы ангиогенеза, мы установили трансгенные инженерные линии мыши, в которых мы не только удалили специфические гены, связанные с ангиогенезом в эндотелиальных клетках, но и расширенный зонд GFP будет генетически помечен на рибосоме родных эндотелиальных клеток. Таким образом, мы можем изолировать и очистить петли связанных РНК-мессенджера от эндотелиальных клеток в различных органах тканей непосредственно у трансгенных животных. Затем мы можем использовать очищенную РНК посланника для анализа стенограмм и транскриптома ниже по течению.
По РНК секвенирования и в режиме реального времени холод ПЦР. В этом видео, мои студенты Патрик Моран и Джордан Палмер и научно-исследовательских техников Николас Барнеков и Rong Yuan покажет вам подход генотипирования трансгенных мышей и аспирирующих посланник РНК непосредственно из эндотелиальных в трансгенных животных. Генотипирование является важным предварительным в этом протоколе, чтобы убедиться, что лед имеет тег GFP на рибосомы эндотелиальных клеток.
Поскольку все этапы изоляции РНК вниз по течению зависят от наличия рибосом GFP с тегами, необходимо определить генотип до начала эксперимента. До начала изоляции РНК необходимо завершить несколько подготовительных шагов. К ним относятся буфер подготовки и связывания анти-GFP антитела к белку G дина бисера.
Буферы могут длиться до одного месяца при четырех градусах по Цельсию, а шарики, связанные антителами, могут длиться до одной недели при четырех градусах Цельсия. Поэтому при планировании эксперимента учитывайте эти ограничения. Использование молярного гомогенизатора является отличным способом повышения урожайности РНК.
Не забудьте использовать более низкие частоты и продолжительности для того, чтобы уменьшить деградацию РНК. Как упоминалось ранее, генотипирование является важным предварительным шагом в протоколе судебного разбирательства. Обеспечение того, чтобы мыши, чья РНК должна быть изолирована с помощью метода TRAP являются положительными для гена TRAP, по крайней мере heterozygotes, но в идеале однородным для гена TRAP является важным шагом, потому что обеспечение GFP тег на рибосоме имеет важное значение для того, чтобы съехать с помощью антигенной реакции антитела и анти-GFP бусы вы подготовили до начала эксперимента.
Изолировать желаемые ткани от мыши и поместить его сразу в ледяной PBS со 100 микрограмм на миллилитр циклохексамид раствора. Это гарантирует, что перевод будет остановлен и что транскриптом будет точное изображение мыши до эвтаназии. Используйте двигательный гомогенизатор для гомогенизации ткани в клеточной подвеске.
Идеальные настройки синхронизации и частоты должны быть определены отдельной лабораторией на основе конкретного моторного гомогенизатора, который вы будете использовать. Использование слишком высокой частоты может привести к деградации РНК и нарушить остальную часть протокола. Приостановить ячейку гранулы в буфере лиза вы должны были подготовить до начала эксперимента.
Не забудьте гомогенизировать эту смесь дальше, с тем чтобы обеспечить адекватную гомогенизацию до начала с остальной частью протокола. Центрифуга гомогената в течение 10 минут при 2000 раз G в четыре градуса Цельсия центрифуги. Это будет гранулы ядер и крупных клеточных мусора, которые могут вмешиваться в реакцию иммунопреципиентации вниз по течению.
Добавьте липиды DHPC и CA-630 к супернатанту с предыдущего шага центробежки. Эти липиды помогут отделить фазы белка от других внутриклеточных компонентов. Поместите подвеску на лед на пять минут и дайте ей посидеть.
Центрифуга лисировать в течение 10 минут при 13000 раз G гранулировать любой растворимый материал. Держите 15% от четкой лисации для будущих шагов. Добавить анти-GFP антитела связаны бусы к клетке лизировать супернатант и инкубировать смесь при четырех градусах по Цельсию с конца над концом вращения в течение 30 минут.
Это где анти-GFP антитела будут связывать GFP помечены рибосомы, что позволяет нам еще больше изолировать РНК от этих рибосом. Соберите бисер на магнитной стойке и мыть бисер пять раз с помощью высокой соли полисом мыть буфер, который вы подготовили до начала изоляции. Немедленно перейти к следующему шагу, в котором вы поместите бисер в буфер RLT.
Центрифуга лизатить в течение трех минут на полной скорости и тщательно удалить супернатант и передать его в новую трубку микрофуга. Добавьте один том 70% этанола в очищенный лисат и немедленно перемешайте с помощью пипетки. Немедленно перейти к следующему шагу, в котором вы будете передавать до 700 микролитров образца, в том числе любой осадок, который, возможно, сформировались, в спин колонке помещены в две миллилитровые трубки сбора.
Центрифуга лисировать в течение 15 секунд при более чем 8000 раз G для мытья мембраны спиновой колонки. Отбросьте поток и перейдите к следующему шагу. Добавьте 350 микролитров буфера RW1 в спиновую колонку.
Центрифуга в течение 15 секунд при более чем 8000 раз G, чтобы вымыть мембрану спиновой колонки и отбросить поток до конца. Повторите этот шаг, используя еще 350 микролитров буфера RW1, прежде чем приступить к следующему шагу. Добавьте 500 микролитров буферного RPE в столбец спина.
Центрифуга в течение 15 секунд при более чем 8000 раз G для мытья мембраны спиновой колонки. Отбросьте поток и повторите этот шаг, добавив еще 500 микролитров буфера RPE в спиновую колонку. На этот раз центрифуга в течение двух минут при более чем 8.000 раз G для мытья мембраны спиновой колонки.
Отбросьте поток и поместите колонку спина в новую двухмилитровую трубку сбора и перейдите к центрифуге на полной скорости в течение одной минуты, чтобы удалить любой остаточный буфер, который может присутствовать на столбце спина. Отбросьте поток и поместите колонку спина в новую трубку сбора 1,5 миллилитров. Продолжить добавить от 30 до 50 микролитров RNase свободной воды непосредственно к мембране позвоночника.
Центрифуга в течение одной минуты при более чем 8000 раз G, чтобы утехать РНК от мембраны спиновой колонки. На данный момент, ваша РНК растворяется в RNase свободной воды и может храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию на срок до одного года. Приступить к количественной оценке и проверить чистоту РНК вы изолировали с помощью спектрофотометра.
Вы ищете пик на 260 нанометров, который является нуклеиновой кислоты, в том числе РНК, поглощается максимально. Количество изображено в нижней правой части изображения в нанограммах на микролитер. Качество может быть выведено по соотношению 260 230, которое отображается на один элемент выше количества в нижней правой части экрана.
Наш подход показал низкую урожайность РНК, особенно когда мы очищали мРНК от тканей сердца или из ранее замороженных тканей. Таким образом, мы должны оптимизировать условия для увеличения урожайности. Тем не менее, мы наблюдали в ЕС конкретных CD-36 дефицитных мышей, уровень эфрина B2 и DLL4 были значительно увеличены в легких и сердца эндотелии, по сравнению с контролем.
Эти результаты соответствовали нашим предыдущим исследованиям in vitro, что говорит о том, что качество РНК достаточно для анализа ниже по течению. Доходность была низкой из-за жестких условий в нашем рабочем пространстве. Чтобы преодолеть это ограничение, крайне важно создать свободную рабочую зону RNase и обеззараживать рабочие поверхности и оборудование, которые могут быть загрязнены RNase и часто менять перчатки, чтобы извлечь качественную РНК и повысить урожайность.
Важно также найти подходящие концентрации антител GFP в матрице сродства и использовать соответствующие концентрации ингибитора RNase в буфере лиза ткани и использовать RNase бесплатную пластиковую посуду и реагенты для извлечения РНК из эндотелиальных рибосом целевых тканей.
