こんにちは、私はビンレンです、私はアラバマ大学バーミンガム医学部の外科と生物医学工学の准教授です。我々の研究室は、これらの一般的な心血管疾患および癌の文脈における血管新生の血管新生機能に興味を持っています。我々の研究の一つは、内皮細胞のトランスセ分化と血管新生のエピジェネティックおよび転写調節に焦点を当てています。
血管新生の転写機構を理解するために、内皮細胞の血管新生に関連する特定の遺伝子を削除しただけでなく、強化されたGFPプローブをネイティブ内皮細胞のリボソームに遺伝的にタグ付けするトランスジェニック工学的マウスラインを確立しました。このようにして、トランスジェニック動物の異なる組織器官の内皮細胞から関連メッセンジャーRNAのループを直接分離して精製することができます。その後、精製されたメッセンジャーRNAを使用して、トランスクリプトとトランスクリプトームの下流分析を行うことができます。
RNAシーケンシングとリアルタイムチルPCRによって。このビデオでは、私の学生パトリック・モランとジョーダン・パーマーと研究技術者ニコラス・バーネコウとロン・ユアンは、トランスジェニックマウスとトランスジェニック動物の内皮から直接吸引メッセンジャーRNAのアプローチを紹介します。ジェノタイピングは、このプロトコルにおいて、氷が内皮細胞のリボソームにGFPタグを持つことを保証するための重要な予備です。
すべての下流のRNAi分離ステップは、GFPタグリボソームの存在に依存しているため、実験を開始する前に遺伝子型を決定することが不可欠です。RNAの単離を開始する前に、いくつかの準備ステップを完了する必要があります。これらには、抗GFP抗体をタンパク質Gディナビーズに対して緩衝製剤および結合させる。
バッファーは摂氏4度で最大1ヶ月間持続することができ、抗体結合ビーズは摂氏4度で最大1週間持続することができます。実験を計画する際には、これらの制限を考慮してください。モル駆動ホモジナイザーを使用すると、RNAの収量を増加させる優れた方法です。
RNA の分解を減らすために、低い周波数設定と持続時間を使用してください。前述のように、ジェノタイピングは試用プロトコルにおける重要な予備ステップです。TRAP技術を用いてRNAを単離するマウスがTRAP遺伝子、少なくともヘテロ接合性の遺伝子に陽性であることを確認するが、理想的にはTRAP遺伝子のホモ接合性が重要なステップである。
マウスから所望の組織を分離し、ミリリットルシクロヘキサミド溶液あたり100マイクログラムの氷冷PBSにすぐに置きます。これにより、翻訳が停止し、転写が安楽死前のマウスの正確な描写になります。モーター駆動のホモジナイザーを使用して、組織を細胞懸濁液に均質化します。
理想的なタイミングと周波数の設定は、使用する特定のモータ駆動ホモジナイザーに基づいて、個々のラボによって決定する必要があります。周波数設定を高くしすぎると、RNA の分解が発生し、プロトコルの残りの部分が中断する可能性があります。実験を開始する前に準備しておく必要のあるリシスバッファー内の細胞ペレットを中断します。
プロトコルの残りの部分を進める前に、適切な均質化を確実にするために、この混合物をさらに均質化してください。ホモジュネートを摂氏4度の遠心分離機で2,000倍Gで10分間遠心分離する。これは、下流の免疫沈降反応を妨げる可能性のある核および大きな細胞破片をペレット化する。
DHPCおよびCA-630脂質を前の遠心分離工程から上清に加えます。これらの脂質は、タンパク質の相を他の細胞内成分から分離するのに役立ちます。懸濁液を氷の上に5分間置き、座るようにします。
13,000倍Gで10分間溶解物を遠心分離し、任意の可溶性物質をペレットする。将来のステップのために明確なlysateの15%を保ちます。抗GFP抗体結合ビーズを細胞の上清に加え、エンドオーバーエンド回転で摂氏4度で30分間インキュベートします。
そこで抗GFP抗体がGFPタグリボソームを結合し、RNAをこれらのリボソームからさらに分離することができます。あなたの磁気ラックにビーズを収集し、分離を開始する前に準備した高塩ポリソーム洗浄バッファーを使用してビーズを5回洗います。すぐに次のステップに進み、RLT バッファにビーズを配置します。
全速力で3分間のリセートを遠心分離し、上清を慎重に取り除き、新しいマイクロフュージチューブに移します。70%エタノールの1つのボリュームをクリアしたライセートに加え、ピペット処理ですぐに混ぜます。形成した可能性のある沈殿物を含むサンプルの最大700マイクロリットルを2ミリリットルの採取チューブに配置されたスピンカラムに移す次のステップに直ちに進みます。
8,000倍Gを超える時に15秒間のリセートを遠心分離し、スピンカラム膜を洗浄する。フローを破棄して、次の手順に進みます。350マイクロリットルのバッファーRW1をスピンカラムに追加します。
遠心分離機は8,000回Gを超える15秒間、スピン柱膜を洗浄し、流れを通して廃棄する。次のステップに進む前に、バッファRW1の別の350マイクロリットルを使用してこのステップを繰り返します。500マイクロリットルのバッファRPEをスピンカラムに追加します。
遠心分離機は8,000倍Gを超える場合に15秒間、スピンカラム膜を洗浄した。流れを破棄し、スピンカラムに500マイクロリットルのバッファRPEを追加してこのステップを繰り返します。このとき、遠心分離機を8.000倍Gより多くで2分間、スピンカラム膜を洗浄した。
流れを破棄し、新しい2ミリリットルの回収チューブにスピンカラムを入れ、フルスピードで1分間遠心分離機に進み、スピンカラムに存在する残留バッファを取り除きます。流れを捨てて、スピンカラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに入れます。スピンカラム膜にRNaseフリーウォーターの30〜50マイクロリットルを直接加えます。
遠心分離機は8,000倍Gを超える1分間、スピンカラム膜からRNAを溶出させる。この時点で、あなたのRNAはRNaseの自由水に溶解し、1年までマイナス80°Cで貯えられるかもしれない。分光光度計を使用して、単離したRNAの純度を定量し、確認します。
RNAを含む核酸である260ナノメートルのピークを探しています。量は、画像の右下の部分に、マイクロリットル当たりのナノグラムで描かれている。品質は、画面の右下の部分の数量の上に1項目を示している260 230比によって推測することができます。
我々のアプローチは、特に心臓組織または以前に凍結した組織からmRNAを精製した場合、低いRNA収量を示した。したがって、我々は、収量を増加させるために条件を最適化する必要があります。しかし、EC特異的CD-36欠損マウスでは、肺および心臓内皮両方においてエフルリンB2およびDLL4のレベルが有意に増加し、対照と比較して観察した。
これらの結果は、RNAの品質が下流の分析に十分であることを示唆する、我々の以前のin vitro研究と一致していた。私たちのワークスペースの厳しい条件のために収量は低かった。この制限を克服するためには、RNaseフリー作業ゾーンを設置し、RNaseに汚染され得る作業面や機器を除染し、品質のRNAを抽出して収量を増やすために手袋を頻繁に交換することが重要です。
また、アフィニティーマトリックス中の適切なGFP抗体濃度を見つけ、組織のリシスバッファーに適切な濃度のRNase阻害剤を使用し、標的組織の内皮リボソームからのRNA抽出にRNaseフリーのプラスチック製品および試薬を使用することも重要です。
