Oi, sou Bin Ren, professor associado de cirurgia e engenharia biomédica na Universidade do Alabama, a Escola de Medicina de Birmingham. Nosso laboratório está interessado em acuogênese da função de biologia celular endotelial no contexto dessas doenças cardiovasculares comuns e cânceres. Uma de nossas pesquisas se concentra na regulação epigenética e transcrição da transdiferenciação efernália celular e angiogênese.
Para entender os mecanismos transcricionais da angiogênese, estabelecemos linhas de camundongos transgênicos, nas quais não só excluímos um gene específico associado à angiogênese nas células endoteliais, mas uma sonda GFP aprimorada será geneticamente marcada em um ribossomo de células endoteliais nativas. Desta forma, podemos isolar e purificar laços de RNA mensageiro associado de células endoteliais em diferentes órgãos teciduais diretamente em animais transgênicos. Podemos então usar o RNA mensageiro purificado para análise a jusante das transcrições e do transcriptome.
Por sequenciamento de RNA e o tempo real chill PCR. Neste vídeo, meus alunos Patrick Moran e Jordan Palmer e os técnicos de pesquisa Nicholas Barnekow e Rong Yuan mostrarão uma abordagem genotipagem de ratos transgênicos e o RNA mensageiro aspirando diretamente da endotelial nos animais transgênicos. Genotipagem é uma preliminar importante neste protocolo para garantir que o gelo tenha a etiqueta GFP nos ribossomos das células endoteliais.
Uma vez que todas as etapas de isolamento RNAi a jusante dependem da presença de ribossomos marcados por GFP, é essencial determinar o genótipo antes de iniciar o experimento. Antes de iniciar o isolamento do RNA, várias etapas preparatórias devem ser concluídas. Estes incluem a preparação do buffer e a vinculação do anticorpo anti-GFP às contas de proteína G dina.
Os buffers podem durar até um mês a quatro graus Celsius e as contas ligadas a anticorpos podem durar até uma semana a quatro graus Celsius. Então leve essas limitações em conta ao planejar seu experimento. Usar um homogeneizador molar é uma excelente maneira de aumentar o rendimento do RNA.
Certifique-se de usar configurações e durações de menor frequência, a fim de reduzir a degradação do RNA. Como mencionado anteriormente, genotipagem é um passo preliminar importante no protocolo de julgamento. Garantir que os camundongos cujo RNA deve ser isolado usando a técnica TRAP sejam positivos para o gene TRAP, pelo menos heterozygotes, mas idealmente homozigos para o gene TRAP é um passo importante, pois garantir que a tag GFP esteja no ribossomo é essencial para puxar para baixo usando a reação de anticorpos de antígeno e as contas anti-GFP que você terá preparado antes de começar o experimento.
Isole os tecidos desejados do camundongo e coloque-o imediatamente em um PBS gelado com 100 microgramas por solução de ciclohexamida mililitro. Isso garante que a tradução será interrompida e que o transcriptome será uma representação precisa do mouse antes da eutanásia. Use um homogeneizador motorizado para homogeneizar o tecido em uma suspensão celular.
As configurações ideais de tempo e frequência terão que ser determinadas pelo laboratório individual com base no homogeneizador acionado pelo motor específico que você estará usando. Usar uma configuração de frequência muito alta pode levar à degradação do RNA e interromper o resto do protocolo. Suspenda a pelota da célula dentro do tampão de lise que você deve ter preparado antes de iniciar o experimento.
Certifique-se de homogeneizar ainda mais essa mistura, a fim de garantir a homogeneização adequada antes de prosseguir com o resto do protocolo. Centrifugar o homogeneizar por 10 minutos a 2.000 vezes G em uma centrífuga de quatro graus Celsius. Isso vai pellet os núcleos e grandes detritos celulares que podem interferir com a reação de imunoprecipitação a jusante.
Adicione lipídios DHPC e CA-630 ao supernatante da etapa de centrifugação anterior. Esses lipídios ajudarão a separar as fases proteicas dos outros componentes intracelulares. Coloque a suspensão no gelo por cinco minutos e deixe-a sentar.
Centrifugar o lysate por 10 minutos a 13.000 vezes G para pelotar qualquer material solúvel. Mantenha 15% do lysate claro para etapas futuras. Adicione as contas de anticorpos anti-GFP ligadas ao supernanato de lise celular e incubar a mistura a quatro graus Celsius com final sobre rotação final por 30 minutos.
É aqui que os anticorpos anti-GFP ligarão os ribossomos marcados pelo GFP, permitindo-nos isolar ainda mais o RNA desses ribossomos. Colete as contas do seu rack magnético e lave as contas cinco vezes usando seu alto tampão de lavagem de sal polisso que você terá preparado antes de iniciar o isolamento. Prossiga imediatamente para a próxima etapa em que você colocará as contas no buffer RLT.
Centrifugar o lise por três minutos a toda velocidade e remover cuidadosamente o supernascer e transferi-lo para um novo tubo de microfuça. Adicione um volume de 70% de etanol ao lise limpo e misture imediatamente por pipetação. Prossiga imediatamente para o próximo passo no qual você irá transferir até 700 microliters da amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado, para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de dois mililitros.
Centrifugar o lise por 15 segundos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro. Descarte o fluxo através e prossiga para o próximo passo. Adicione 350 microliters de buffer RW1 à coluna de giro.
Centrifugar por 15 segundos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro e descartar o fluxo através. Repita esta etapa usando outros 350 microliters de buffer RW1 antes de prosseguir para a próxima etapa. Adicione 500 microliters de RPE tampão à coluna de giro.
Centrífuga por 15 segundos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro. Descarte o fluxo através e prossiga para repetir esta etapa adicionando mais 500 microliters de RPE tampão à coluna de giro. Desta vez, centrífuga por dois minutos a mais de 8.000 vezes G para lavar a membrana da coluna de giro.
Descarte o fluxo através e coloque a coluna de giro em um novo tubo de coleta de dois mililitros e proceda à centrífuga a toda velocidade por um minuto para remover qualquer tampão residual que possa estar presente na coluna de giro. Descarte o fluxo através e coloque a coluna de giro em um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro. Prossiga para adicionar 30 a 50 microliters de água livre RNase diretamente à membrana da coluna de spin.
Centrífuga por um minuto a mais de 8.000 vezes G para elutar o RNA da membrana da coluna de spin. Neste ponto, seu RNA é dissolvido em água livre de RNase e pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius por até um ano. Proceda para quantificar e verificar a pureza do RNA que você isolou usando um espectrômetro.
Você está procurando um pico de 260 nanômetros, que é o ácido nucleico, incluindo RNA, absorve ao máximo. A quantidade é retratada na parte inferior direita da imagem em nanogramas por microliter. A qualidade pode ser inferida pela razão 260 230, que é mostrada um item acima da quantidade na porção inferior direita da tela.
Nossa abordagem mostrou baixos rendimentos de RNA, especialmente quando purificamos o mRNA dos tecidos cardíacos ou de tecidos previamente congelados. Precisamos, assim, optomizar as condições para aumentar os rendimentos. No entanto, observamos em EC camundongos deficientes cd-36 específicos, o nível de efrina B2 e DLL4 foram significativamente aumentados tanto na endothelia pulmonar quanto no coração, quando comparado com o controle.
Esses resultados foram consistentes com nossos estudos in vitro anteriores, o que sugere que a qualidade do RNA é suficiente para análise a jusante. O rendimento foi baixo devido às condições rigorosas em nosso espaço de trabalho. Para superar essa limitação, é fundamental criar uma zona de trabalho livre RNase e descontaminar superfícies de trabalho e equipamentos que possam se contaminar com RNase e trocar luvas com frequência, a fim de extrair RNA de qualidade e aumentar os rendimentos.
Também é fundamental encontrar concentrações adequadas de anticorpos GFP na matriz de afinidade e usar concentrações apropriadas do inibidor de RNase no tampão de tecido e usar utensílios plásticos e reagentes livres de RNase para extração de RNA de ribossomos endoteliais dos tecidos alvo.
